一种液态胶原填充剂的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种液态胶原填充剂的制备方法，其主要组分为I型胶原蛋白，其中胶原蛋白具有完整的天然的三螺旋结构，且其羟基脯氨酸含量大于9%。由所述的I型胶原蛋白制备的I型无毒交联胶原蛋白粉，特别适用于制备液态胶原填充剂，所得液态胶原填充剂不仅可用作内镜下黏膜切除术（EMR）或内镜黏膜下剥离术（ESD）病灶的隆起剂，隆起高度以及支撑时间长度合理，在手术中有一定的止血作用，应用效果非常好；还可以用做软组织填充扩张剂，最终在体内降解并能完全被组织吸收。

Preparation of a liquid collagen filling agent

The invention discloses a preparation method of liquid collagen filler, which is mainly composed of type I collagen, wherein collagen has a complete natural three helix structure, and its hydroxyproline content is more than 9%. The type I collagen type I prepared non-toxic crosslinked collagen powder, especially suitable for preparing liquid collagen filler, the filler can be used not only as a liquid collagen endoscopic mucosal resection (EMR) or endoscopic submucosal dissection (ESD) agent uplift lesions, uplift height and length of time with reasonable support, the hemostatic effect in operation, a very good application effect; can also used as soft tissue filling agent expansion, the final degradation in the body and can be completely absorbed by tissues.

【技术实现步骤摘要】
一种液态胶原填充剂的制备
本专利技术涉及生物材料学领域，是一种I型胶原蛋白，及由其制备的液态胶原填充剂。
技术介绍
目前，随着内镜检查的普及，癌前病变与早癌检出率逐渐升高。内镜黏膜下层剥离术（ESD）或内镜黏膜下层切除术（EMR）逐渐成为一种切除消化道癌前病变与早癌的一种标准微创治疗手段，它能够将病变完整地整块切除，从而大大降低了肿瘤复发的风险。ESD手术也存在较大风险，可能发生一些并发症，主要包括消化道穿孔和出血。针对患者发生穿孔这一现象，为了使其更加安全和方便，目前国内外多数学者研究证实，在手术切除之前进行黏膜下注射可以减少此类并发症的发生。目前研究涉及到的黏膜下注射液有生理盐水、高渗盐水、葡萄糖、甘油果糖、不同浓度的透明质酸钠及羟甲基纤维素、纤维蛋白原等。但这些黏膜下注射液在临床应用中仍存在一些不足。例如生理盐水注射后液体向周围组织扩散快且维持病变黏膜隆起的时间短，大多数在切除手术还没有完成时由生理盐水注射形成的局部隆起形状已经部分消失。而高渗盐水等其他注射液则会存在不同程度的组织损伤作用；因鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是使用一种无毒的交联剂对I型胶原蛋白进行交联，经过冷冻研磨技术制备100~200um的I型胶原蛋白粉。本专利技术的另一目的是利用上述I型胶原蛋白粉制备高度均一液态胶原填充剂。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：本专利技术中所用的I型胶原蛋白，具有完整的天然的三螺旋结构的I型胶原蛋白且其中羟基脯氨酸含量大于9%（I型胶原蛋白中羟脯氨酸约占胶原蛋白的9~13%，参见《中华人民共和国医药行业标准：组织工程医疗产品第6部分：I型胶原蛋白》）。研究发现该胶原蛋白热稳定性好，空间支撑作用持久，对病灶隆起作用时间长度适中，不需要后期取出，而且对手术创口处渗血起到及时止血作用，有助于伤口的快速修复；基于这些特性，本专利技术提供了上述I型胶原蛋白在制备液态胶原填充剂中的应用。液态胶原填充剂可以被注射到病变黏膜下层，在病变和固有肌层之间形成一个黏膜下液体垫层，将病变黏膜托起，当病变黏膜被切除时可以防止穿孔的发生、起到止血作用并促进被切除表面的愈合。液态胶原填充剂可被用于发生病变的消化器官黏膜处。虽然目前市场上以胶原为基质的生物材料不少，例如胶原蛋白海绵、可吸收胶原蛋白缝合线、医用胶原膜、胶原帖敷料、胶原蛋白植入剂（双美）、医用胶原充填剂（肤美达）等，但对于ESD或EMR手术来说，既要求黏膜下液体垫能够被注射到病变处且在手术期间持续支撑，又要求在手术完成后能被组织自行吸收而不必取出以避免给患者造成二次损伤，所以现有的胶原基质生物材料都无法适用，本专利技术的I型胶原蛋白制备成液态胶原填充剂则符合这样的要求，持续时间适当，胶原蛋白可在体内自行降解，使用效果好。本专利技术提供了一种I型胶原蛋白粉，最适用于制备液态胶原填充剂，制备方法具体包括以下步骤：（1）I型胶原蛋白加入到盐酸溶液中，充分搅拌，用正压过滤器进行过滤得到滤液，再用氢氧化钠调节酸碱度并不断搅拌，制备出PH值为6~7的浆液；（2）对滤液进行冷冻干燥；（3）将冻干后的样品浸泡在含有无毒交联剂的缓冲溶液中，4℃进行交联反应，反应产物用磷酸氢二钠溶液浸泡1~4h，再用去离子水清洗；（4）对清洗后的样品进行冷冻干燥；（5）对冻干后的样品进行粉碎，得到粒径为100~200um的胶原蛋白粉。作为一种优选方案，上述I型胶原蛋白粉，制备方法具体包括以下步骤：（1）I型胶原蛋白加入到盐酸溶液中，充分搅拌，用正压过滤器进行过滤得到滤液，再用氢氧化钠调节酸碱度并不断搅拌，制备出PH值为6~7的浆液；（2）对滤液进行冷冻干燥；（3）将冻干后的样品浸泡在含有无毒交联剂的缓冲溶液中，4℃进行交联反应，反应产物用磷酸氢二钠溶液浸泡1~4h，再用去离子水清洗；（4）对清洗后的样品进行冷冻干燥；（5）对冻干后的样品进行粉碎，得到粒径为100~200um的胶原蛋白粉。作为一种优选方案，上述I型胶原蛋白粉，步骤（1）中将I型胶原蛋白加入到盐酸溶液中，制成浆液再经正压过滤器过滤的目的是去除未溶解的胶原纤维，再用氢氧化钠调节酸碱度，才能制得高度均一的中性胶原浆液。其中，I型胶原蛋白与盐酸溶液的质量体积比为0.01%~5%，盐酸溶液浓度为0.001~0.5mol/L，搅拌速度为1000~1500r/min，时间为2~4h；氢氧化钠的浓度为0.01~3mol/L，搅拌速度为1200~2000r/min，时间为1~4h。作为一种优选方案，上述I型胶原蛋白粉，步骤（2）中冷冻干燥按照以下步骤进行：a.预冷冻：先于-40℃下预冷冻60min，再于-20℃下预冷冻120~160min，并保持冷冻干燥机冷柜的温度在-60~-50℃；b.干燥：先于-20℃干燥5h，然后于-10℃干燥5h，再于0℃干燥5h，于10℃干燥5h，于20℃干燥12h；预冷冻和干燥阶段环境真空度为200~350毫托；进行冷冻干燥的目的是，将浆液冻干成胶原海绵，为下一步的交联提供海绵状的胶原样品。作为一种优选方案，上述I型胶原蛋白粉，步骤（3）的交联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）/NHS，EDC交联剂具有无毒、生物相容性良好的特点。因为EDC只是帮助胶原分子的羧基和氨基之间形成酰胺键，而本身并没有成为实际交联的一部分，EDC首先是和胶原分子的羧基偶合形成一个O-异酰基脲结构，这一活化中间物受到-NH2基团进攻形成酰胺交联，而活化中间物可以消除并被清洗掉。因EDC和NHS是可溶于水的物质，经过多次纯水清洗，可以将残留的EDC和NHS洗掉。其中EDC的浓度为0.05~5g/l，EDC与NHS的摩尔比为1:1~6:1，用MES为缓冲剂将溶液的PH值调为5.3~5.7，交联18~24h；磷酸氢二钠溶液的浓度为0.001~1mol/l。用磷酸氢二钠浸泡的目的是中和EDC中的HCl。作为一种优选方案，上述I型胶原蛋白粉，步骤（4）中的冷冻干燥按照以下步骤进行：a.预冷冻：先于-40℃下预冷冻60min，再于-20℃下预冷冻150~180min，并保持冷冻干燥机冷柜的温度在-60~-50℃；b.干燥：分别依次于-20℃干燥7h、-15℃干燥7h、-10℃干燥7h、0℃干燥7h，再于20℃干燥15h；预冷冻和干燥阶段环境真空度为200~350毫托；设置先预冷冻，再干燥，可以使需要冻干的样品中的水份含量降到15%以下，这样更利于下一步的冷冻研磨。作为一种优选方案，上述I型胶原蛋白粉，步骤（5）的粉碎采用冷冻研磨方式，研磨温度为-196℃，研磨时间为4~15min。在极低温度下，样品会变脆，更容易研磨并达到所需的粒径要求；同时该温度下进行研磨使胶原蛋白的三螺旋结构不受到任何破坏。本专利技术还提供了一种液态胶原填充剂，是由以上任一所述的I型胶原蛋白粉，悬浮于磷酸盐缓冲液或悬浮于生理盐水中制备而成；悬浮液中胶原的平均粒径为50~80μm；因为在临床上使用时，胶原粒径越小越容易通过导管注射到所需部位，胶原粒径越小使医生操作时手术视野更清晰，方便医生操作。作为一种优选方案，上述液态胶原填充剂，当使用上述I型胶原蛋白粉时，将I型胶原蛋白粉按照质量体积比为0.01:100~50:100加入到磷酸盐缓冲液或生理盐水中，在设定温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种液态胶原填充剂，其特征在于，由I型胶原蛋白粉，悬浮于磷酸盐缓冲液或悬浮于生理盐水中制备而成；悬浮液中胶原的平均粒径为50~80μm；I型胶原蛋白粉与磷酸盐缓冲液或生理盐水的质量百分比为0.01:100~50:100。

【技术特征摘要】
1.一种液态胶原填充剂，其特征在于，由I型胶原蛋白粉，悬浮于磷酸盐缓冲液或悬浮于生理盐水中制备而成；悬浮液中胶原的平均粒径为50~80μm；I型胶原蛋白粉与磷酸盐缓冲液或生理盐水的质量百分比为0.01:100~50:100。2.权利要求1所述的液态胶原填充剂的制备方法是：当使用I型胶原蛋白粉时，先将I型胶原蛋白粉加入到磷酸盐溶液或生理盐水中，在设定温度为0~15℃、压力为800~1300bar条件下进行高压均质4~8次至胶原平均粒径降至50~80μm，得到液态胶原填充剂。3.权利要求1和权利要求2所述的I型胶原蛋白粉，其特征在于，由具有完整的天然的三螺旋结构的I型胶原蛋白制成，其制备方法具体包括以下步骤：（1）I型胶原蛋白加入到盐酸溶液中，充分搅拌，用正压过滤器进行过滤得到滤液，再用氢氧化钠调节酸碱度并不断搅拌，制备出PH值为6~7的浆液；（2）对滤液进行冷冻干燥；（3）将冻干后的样品浸泡在含有无毒交联剂的缓冲溶液中，4℃进行交联反应，反应产物用磷酸氢二钠溶液浸泡1~4h，再用去离子水清洗；（4）对清洗后的样品进行冷冻干燥；（5）对冻干后的样品进行粉碎，得到粒径为100~200um的胶原蛋白粉。4.根据权利要求1~3所述的I型胶原蛋白粉，其特征在于，步骤(1)中的I型胶原蛋白与盐酸溶液的质量体积比为0.01%~5%，盐酸溶液浓度为0.001~0.5mol/l，搅拌速度为1000~1500r/min，时间为2~4h；氢氧化钠的浓度为0.01~3mol/l，搅拌速度为1200~2000r...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧敏，富勇，
申请(专利权)人：北京华信佳音医疗科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11