盘状网柱菌二肽氨肽酶,其分离方法及用途技术

本发明专利技术涉及从细胞粘液霉菌－盘状网柱菌中分离得到一种新的二肽氨肽酶。这个新的ＤＡＰ酶，即ｄＤＡＰ，具有类似ＤＡＰ－Ⅰ与ＤＡＰ－Ⅲ两者的活性，但在物理及其它酶学特征上与这些酶有很明显的区别。本发明专利技术还涉及利用ｄＤＡＰ酶从重组产生的前体蛋白及肽类的Ｎ－末端移去二肽的方法。此外，本发明专利技术还涉及从盘状网柱菌中分离和纯化ｄＤＡＰ酶的方法。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物
更确切地说，本专利技术涉及从粘液霉菌盘状网柱菌中分离得到的一种二肽氨肽酶，它可用于加工重组产生的生物化合物。盘状网柱菌是一种原始的真核微生物，通常被称为粘液霉菌，或者更确切地称为细胞粘液霉菌。这个名称是从肉眼观察到的该微生物的两个极端状态而来的。当活跃生长时，盘状网柱菌生长为单细胞变形虫。在这个阶段它们没有细胞壁，因此它们外表为一层薄膜(或者粘液)。在固体培养基并处于饥饿状态下，各个独立的细胞聚集形成一个集落。这个集落呈现一种多细胞生物体的特征，因为它以蛞蝓的方式移动，然后进行分化。它后面的细胞形成一个足，前面的细胞形成一个柄，而中间的细胞形成一个果实体。这个生物体天然是在泥土和粪肥的表面发现的。野生型变形虫只通过摄取(吞噬)整个的细菌来获得营养，因此它们有时被称为是食肉的。盘状网柱菌的无外来污染的突变体已被分离出来，它们能在无“食物”细菌的共培养下生长，所以能生长在可溶培养基中。本专利技术涉及从盘状网柱菌中分离的二肽氨肽酶。二肽氨肽酶(DAP)是水解氨基端倒数第二个肽键的酶，从肽的蛋白质的未封闭的氨基端释放二肽。目前有四类二肽氨肽酶(称做DAP-Ⅰ，DAP-Ⅱ、DAP-Ⅲ和DAP-Ⅳ)，它们的区别在于其物理性质及其催化裂解不同的多肽氨基端序列的速率的差异。DAP-Ⅰ是一种从蛋白质和肽类未封闭的氨基末端催化释放出许多二肽复合物的相对非特异性的DAP。如果出现的二肽是Ⅹ-Pro、Arg-Ⅹ或者Lys-Ⅹ(Ⅹ为任何一种氨基酸)，那么DAP-Ⅰ几乎不显示活性。DAP-Ⅱ对氨基端二肽顺序为Arg-Ⅹ或Lys-Ⅹ的优先，其次为Ⅹ-Pro，而对其余大多数二肽复合物DAP-Ⅱ的裂解速率显著降低。DAP-Ⅲ似乎对氨基端二肽顺序为Arg-Arg和Lys-Lys的具有倾向性。DAP-Ⅳ对二肽顺序为Ⅹ-Pro的显示最高的水解活性。DAP酶，尤其是DAP-Ⅰ与DAP-Ⅳ在处理加工蛋白质方面已显示出其用途。本专利技术涉及盘状网柱菌中的一种新DAP，它用于加工以偶数个氨基酸N-末端延伸的重组蛋白。本专利技术涉及从细胞粘液霉菌-盘状网柱菌中分离的一种新二肽氨肽酶。这个新的二肽氨肽酶-dDAP显示出有些类似DAP-Ⅰ和DAP-Ⅲ两者的活性，但在物理和其它的酶特征方面又与它们有显著区别。本专利技术还涉及利用dDAP酶从重组产生的前体蛋白或前体多肽的N-末端移去二肽的方法。本专利技术的dDAP酶可用于从多肽的N-末端移去单个二肽，也可用于从前体多肽的N-末端顺序移去一个以上的二肽。此外，本专利技术还涉及从盘状网柱菌的培养物中分离纯化此dDAP酶的方法。就本专利技术目的而言，在本文说明书和权利要求书所用的下列术语及缩写定义如下dDAP为一种从盘状网柱菌中分离得到的二肽氨肽酶，用GFPNA作底物证明其最适pH为pH3.5，用超离心分析测得其他分子量约为225，000道尔顿，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得知其单个亚基的分子量约为66，000道尔顿。GFPNA为甘氨酰-苯丙氨酰-对硝基苯胺。前体多肽为一种重组产生的多肽，它包括由从有意义的期望的多肽的氨基末端延伸的偶数个氨基酸。加工后多肽为一种多肽，其中N-末端二肽或多个二肽已被移去，生成有意义的目的多肽。RRBNA为精氨酰-精氨酰-β-萘胺本公开应用的所有氨基酸缩写均被美国专利与商标局在37C.F.R.§1.822(b)(1990)中认可。本专利技术是针对一种从细胞粘液霉菌盘状网柱菌中分离出的一种二肽氨肽酶，dDAP。dDAP酶显示出裂解未封闭氨基末端顺序的倾向，而它们过去习惯上由DAP-Ⅰ和DAP-Ⅲ共同完成，即便如此，dDAP在物理及其它酶学特性上与这些酶存在明显区别。dDAP以GFPNA为底物测得其最适pH约为pH3.5，天然dDAP分子量约为225，000道尔顿，而单个亚基的分子量约为66，000道尔顿。凝集素亲合色谱表明dDAP很可能是一个糖蛋白。dDAP酶能从合成的底物GFPNA和RRBNA以及其它许多合成的和重组产生的多肽上移去二肽。已知的DAP-Ⅰ酶已从多种动物及动物组织中分离得到。新酶dDAP是从盘状网柱菌的培养物中分离得到的。DAP-Ⅰ酶需要卤化物和还原剂才有活性。还原剂(如碘代乙酸盐，它修饰半胱氨酸巯基)钝化DAP-Ⅰ酶。DAP-Ⅰ在pH5-6之间有最理想的活性。与此相反，以GFPNA或RRBNA作底物，dDAP酶的最适pH约为3.5，而且在pH3.5条件下dDAP对蛋白质和肽也具显著活性，但它在pH＞6条件下无明显活性。dDAP酶无需添加还原剂并且在半胱氨酸修饰物(如碘代醋酸盐和连四硫酸盐)的存在下仍具完全活性。dDAP与牛DAP-Ⅰ相似，因为它不能裂解N-末端封闭的肽，但是dDAP又与牛DAP-Ⅰ不同，它对N-末端具有氧化的甲硫氨酸底物仍具活性，而DAP-Ⅰ不能裂解在N-末端具有氧化的甲硫氨酸的底物。此外，与牛DAP-Ⅰ不同，dDAP酶能够容易地裂解RRBNA底物。这种裂解包含裂解Arg-Arg二肽基的氨基末端底物的能力，与哺乳和微生物来源的DAP-Ⅲ酶活性很相似。虽然据报道DAP-Ⅲ酶在碱性范围内具有最适pH，而dDAP在酸性范围具有最有效作用。据SDS-PAGE测定，dDAP亚基分子量约为66，000道尔顿，而哺乳动物DAP-Ⅰ的亚基分子量约为22，000道尔顿。本专利技术的dDAP酶对于将前体多肽转变为加工后多肽非常有用。例如，若目的多肽是人类生长激素，那么只需表达此激素的前体(在一实例中，Met-Asp-人类生长激素)，然后将此前体在dDAP的作用下释放出二肽Met-Asp和加工后的目的多肽人生长激素。加工后的肽无需是“天然”的野生型多肽，因为通常希望产生类似物或中间体。加工前体多肽的方法也是本专利技术的一个部分。可被dDAP加工的其它前体多肽包括Met-Arg-人生长激素，Met-Tyr-胰岛素原，Met-Arg-胰岛素原，Met-Arg-胰岛素原类似物(B28Lys，B29Pro)，Met-Arg-胰岛素原类似物(B10Asp，des B28-30)和Met-Tyr-胰岛素原类似物(B10 Asp，des B28-30)。胰岛素类似物(B28 Lys，B29 Pro)公开在欧洲专利申请序号为90301224.3中，而胰岛素类似物(B10 Asp，des B28-30)公开在欧洲专利申请序号为92305678.2中。此外，dDAP还可用于从前体多肽N-末端顺序地移去一个以上的二肽。用牛DAP-Ⅰ加工Met-Arg-胰岛素原及其类似物公开于美国专利申请5，126，249号中(1992年6月30日授予Becker等人)。所有这些教导均作为参考文献并入本文中。利用dDAP酶从前体蛋白质移去二肽是有利的，因为dDAP最适pH约为3.5，这就允许反应在许多前体多肽可溶的酸性pH范围内进行。再者，在中性或更高pH条件下一些前体多肽的转化会导致链间二硫聚合物或底物多聚体生成水平增加，而这伴随着产物产量损失。这个现象叫作二硫化物混杂(scrambling)，尤其在使用牛DAP-Ⅰ时很麻烦，因为DAP-Ⅰ在反应混合物中需要还原试剂的存在，如β-巯基乙醇或半胱氨酸。而且在酸性pH范围里甲硫氨的残基的氧化发生率较低。此外，从盘状网柱菌发酵培养物中分离的酶比从动本文档来自技高网...

【技术保护点】
从盘状网柱菌中分离得到的一种ｄＤＡＰ酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PR阿特金森，MD希尔顿，PK兰布伊，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]