用于检测靶核酸的方法和试剂盒技术

本申请涉及用于分析核酸扩增产物的方法和试剂盒，并且更具体地涉及使用标记的引物个使用膜分析核酸扩增产物的方法和试剂盒，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区、(ii)含有与所述靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体和(iii)标记，所述膜具有固定于其上的与所述核酸寡聚体互补结合的探针。

Method and kit for detecting target nucleic acid

The invention relates to a method and kit for analysis of nucleic acid amplification products, and more particularly relates to the use of labeled primer using film analysis method and kit for nucleic acid amplification products, the primers containing (I) and complementary target nucleic acid binding region (II) and oligo nucleic acid containing the target nucleic acid non complementary the nucleotide dimer (III) marker, and the membrane is fixed on it with the nucleic acid oligomer complementary binding probe.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测靶核酸的方法和试剂盒
本申请涉及用于分析靶核酸的方法和试剂盒，并且更具体地涉及使用引物和使用膜检测和分析核酸的方法和试剂盒，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及(iii)带有标记的引物，所述膜具有固定于其上的与核酸寡聚体互补结合的探针。
技术介绍
分子诊断在各个诊断领域，包括传染病诊断、癌症诊断、遗传疾病诊断和个性化诊断领域，用于检测疾病的基本原因，诸如DNA或RNA分子。典型的分子诊断技术是用于在短时间内扩增DNA的PCR技术(Saiki,R.,et.al.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science239,487-91.1998)。然而，在一般PCR技术中，应该使用电泳来确认扩增的DNA。在所述电泳前，应该进行复杂的操作，其包括制作琼脂糖凝胶和使用EtBr等染色DNA。由于此原因，电泳不适合在临床实验室中使用。最近使用的实时PCR技术基于荧光，并且因此不需要电泳，但是因为使用昂贵的仪器和昂贵的荧光试剂而具有缺陷(Higuchi,R.,et.al.,KineticPCRAnalysis:Real-timeMonitoringofDNAAmplificationReactions.NatureBiotechnology11,1026-1030,1993)。此外，这些技术具有的缺点在于，因为要使用的荧光波长受限，所以实际上难以对五种或更多种样品进行多重PCR。由于这些原因，在实验室中通过使用PCR技术进行便宜的临床测试具有许多困难，并且因此PCR技术主要用于大型医院，诸如大学医院。近年来，已经开发并上市了用于现场诊断(on-sitediagnosis)的GeneXpert系统和试剂(Cepheid)。然而，这些系统和试剂非常昂贵，并且因此几乎不用于一般临床测试(Helb,D.,et.al.,RapidDetectionofMycobacteriumtuberculosisandRifampinResistancebyUseofOn-Demand,Near-PatientTechnology.J.Clin.Microbiol.48,229-237,2010)。其他技术包括在PCR后使用膜代替凝胶电泳(核酸侧向流动测定)进行的核酸侧向流动测定(lateralflowassay)(Aveyard,J.,et.al.,OnestepvisualdetectionofPCRproductswithgoldnanoparticlesandanucleicacidlateralflow(NALF)device.Chem.Commun.,41,4251-4253,2007)。然而，这种核酸侧向流动测定比凝胶电泳技术更复杂，并且因此不可能用于实验室。此外，因为具有认为应该使用附着于膜的探针的序列以便其可与PCR扩增产物特异性结合的技术局限，所以限制了核酸侧向流动测定的普遍使用。在此技术背景下，本申请的专利技术人发现，当允许人工合成的PCR引物中的核酸寡聚体与在膜上与核酸寡聚体互补的探针反应而不管扩增产物的类型时，各种PCR产物普遍可使用单一类型的膜鉴别，从而完成本申请。在
技术介绍
部分公开的信息仅用于增强理解本申请的背景，并且因此可能不含形成本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
技术实现思路
技术问题本申请的专利技术人认识到上述发生在本领域中的问题，并且本申请的目的是提供用于检测和分析多种靶核酸的通用方法，其可以比常规电泳法更准确和更简单的方式分析由扩增靶核酸而产生的扩增核酸，并且其可同时鉴别多种靶核酸，以及用于所述方法的试剂盒。技术方案为了实现上述目的，本申请提供了用于检测靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)通过使包含靶核酸的样品与引物反应而扩增靶核酸，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及(iii)带有标记的引物；(b)使步骤(a)中扩增的产物与膜反应，所述膜具有固定于其上的与所述核酸寡聚体互补的探针；以及(c)确认反应是否由标记显示，以检测所述靶核酸是否会被扩增。本申请还提供了用于检测靶核酸的试剂盒，其包含：(a)引物，其包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及带有标记的引物；和(b)膜，其具有固定于其上的与核酸寡聚体互补结合的探针。附图说明图1显示根据本申请的实施方案的用于检测核酸扩增产物的方法。图2显示根据本申请的实施方案的通过侧向流动测定检测和分析靶核酸的通用技术。图3显示通过根据本申请的实施方案的检测靶核酸扩增产物的方法分析HPV16和HPV18靶核酸扩增产物的结果。具体实施方式除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。通常，以下将描述的本文所使用的命名和实验方法是本领域中众所周知和通常使用的那些。一方面，本申请涉及用于检测靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)通过使包含靶核酸的样品与引物反应而扩增靶核酸，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，和(iii)带有标记的引物；(b)使步骤(a)中扩增的产物与膜反应，所述膜具有固定于其上的与所述核酸寡聚体互补的探针；以及(c)确认反应是否由标记显示，以检测所述靶核酸是否会被扩增。在分子诊断中最频繁使用的方法基于聚合酶链式反应(PCR)。此方法是用于在几个小时内扩增微量的特定DNA的技术，并且与免疫诊断的敏感性相比，其敏感性可急剧增加。然而，一般PCR技术不方便，因为扩增产物应当通过凝胶上的电泳确认。近年来，已经使用基于荧光的实时PCR技术，但是这些技术需要复杂且昂贵的系统和昂贵的PCR试剂，并且因此难以用于一般实验室。因此，本申请提供一种技术，其中，以比常规电泳法更准确和更简单的方式分析由扩增靶核酸(包括PCR)产生的扩增基因。根据本申请的用于检测靶核酸的方法包括(a)合成引物，其包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，和(iii)带有标记的引物，以及使靶核酸与合成的标记引物反应，从而扩增靶核酸。为了通过PCR扩增靶基因(核酸)，将大约10-40bp、优选大约20-30bp的包含与靶核酸非互补的核苷酸，即不与靶核酸连接的基因的核酸寡聚体，加入至引物，并且使用合成引物扩增靶基因。然后，在膜上固定大约10-40bp，优选大约20-30bp的与核酸寡聚体互补的探针，并且将探针杂交至靶核酸。将大约10-40bp、优选20-30bp的核酸寡聚体加入至用于一般多重PCR检测的引物末端，并且将使用引物获得的扩增产物与膜上的互补探针寡聚体反应，由此可以确定靶核酸是否会被扩增。这使得同时诊断几种疾病成为可能。即，当使用具有几种至几十种不同的寡聚体序列进行多重PCR，然后允许PCR扩增产物和与寡聚体序列互补的探针反应时，几种至几十种扩增产物可使用单一侧向流动膜(lateralflowmembrane)鉴定。因此，因为侧向流动膜通常可以用于各种多重PCR测定，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)通过使包含靶核酸的样品与引物反应而扩增靶核酸，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及(iii)带有标记的引物；(b)使步骤(a)中扩增的产物与膜反应，所述膜具有固定于其上的与所述核酸寡聚体互补结合的探针；以及(c)确认反应是否由标记显示，以检测所述靶核酸是否会被扩增。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.22 KR 10-2015-00719451.一种用于检测靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)通过使包含靶核酸的样品与引物反应而扩增靶核酸，所述引物包含(i)与靶核酸互补的结合区和(ii)包含与靶核酸非互补的核苷酸的核酸寡聚体，以及(iii)带有标记的引物；(b)使步骤(a)中扩增的产物与膜反应，所述膜具有固定于其上的与所述核酸寡聚体互补结合的探针；以及(c)确认反应是否由标记显示，以检测所述靶核酸是否会被扩增。2.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)的核酸寡聚体的长度是10-40bp。3.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)的核酸寡聚体包含一个或多个选自SEQIDNO:1至3的序列。4.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)包括将步骤(a)的扩增产物注射至所述膜的侧面，使得包含在所述扩增产物中的核酸寡聚体可与固定在所述膜上的探针互补杂交，同时所述扩增产物移动。5.权利要求1的方法，其中与所述步骤(b)的核酸寡聚体互补结合的探针包含一个或多个选自SEQIDNO:10至12的序列。6.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)的探针另外包含用于固定在所述膜上的核酸寡聚体。7.权利要求6的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴荣石，
申请(专利权)人：和平基因生物有限公司，朴荣石，
类型：发明
国别省市：韩国,KR