低温好氧反硝化菌的富集分离方法及水体治理方法技术

本发明专利技术公开一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法。包括如下步骤，(1)制备底泥悬浊液和富集培养液，并将底泥悬浊液与富集培养基混合进行数轮的富集培养获得低温好氧反硝化菌群；(2)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基，对牛肉膏蛋白胨固体培养基进行高温灭菌处理并制得固体平板；(3)对步骤(1)中得到的低温好氧反硝化菌群进行单菌落分离，得到单菌落；并将得到的单菌落接种于步骤(2)中的灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并进行杜氏管产气检验，得到低温好氧反硝化菌株；(4)利用牛肉膏蛋白胨液体培养基对获得的低温好氧反硝化菌株进行发酵培养得到低温好氧反硝化菌液。

Enrichment and separation of aerobic denitrifying bacteria at low temperature and water treatment method

The invention discloses a method for enrichment and separation of low temperature aerobic denitrifying bacteria. Includes the following steps: (1) preparation of sediment suspension and enrichment medium, and sediment suspension and enrichment medium were mixed for the low-temperature aerobic denitrifying bacteria in several rounds of enrichment; (2) preparing solid beef extract peptone medium and beef extract peptone liquid medium, beef peptone solid medium high temperature sterilization and preparation of solid plate; (3) to step (1) obtained in low temperature aerobic denitrifying bacteria were isolated from single colonies, single colonies; and then the single colonies were inoculated in the step (2) medium of beef extract peptone in liquid sterilization, and from gas test, low temperature aerobic denitrifying bacteria; (4) using beef extract peptone liquid medium to obtain low-temperature aerobic denitrifying bacterium was cultured in low temperature aerobic denitrifying bacteria liquid.

【技术实现步骤摘要】
低温好氧反硝化菌的富集分离方法及水体治理方法
本专利技术属于环境微生物菌种分离与应用领域，尤其涉及一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法及水体治理方法。
技术介绍
随着国家工农业的快速发展，经济快速增长，随之而来的便是水资源污染，水环境生态破坏。硝酸盐是引起水体富营养化，影响饮用水水质的重要污染指标之一，同时也是地下水主要污染物之一。目前水体硝酸盐污染已成为全球范围内日益严重的问题，其不仅对生态环境造成影响，也会危害人类健康。地表水中硝酸盐浓度过高，会使得藻类大量生长，形成水华，继而形成“湖泛”破坏生态系统。饮用水中过量的硝酸盐则会导致“兰婴”综合症和胃癌、结直肠癌、淋巴癌等癌症发病率升高。自然环境中，氨氮可通过硝化菌最终氧化生成硝酸盐，硝酸盐在底泥厌氧环境中通过反硝化作用，生成氮气进入大气，完成脱氮过程。由于水体生态破坏，人为工程治理改造(如清淤、底质硬化工程)，健康底泥的削减也带来了反硝化作用的减弱，继而造成了水体硝酸盐浓度超标。传统理论认为，反硝化是一个严格厌氧的过程，氧气会抑制反硝化还原酶。因而反硝化菌和其他好氧微生物菌剂在水体治理中存在生态位的不融合现象。20世纪80年代，Robertson首次发现了好氧反硝化过程的存在，截至目前，已有多例研究证明了好氧反硝化菌的存在。好氧反硝化菌的发现为生物脱氮技术提供了崭新的思路。好氧反硝化速率相比厌氧途径较慢，但由于该类群代时短，生物量较厌氧反硝化菌增长快，总反硝化速率也不容小觑，工业化生产也较为容易。好氧反硝化菌可和其他好氧微生物共存，使得该类群具有较强的工程应用价值，可结合曝气等工艺，达到降解底物的目的。中国地域辽阔造成了不同地区的水环境差异巨大，尤其冬季及北方地区，地表水温度较低。环境微生物的活性大多和温度呈正相关，在气温较低的冬季，其代谢速率下降显著，因而分离适应低温环境的功能微生物也有较高的应用价值。正是由于该类群微生物有较高的应用价值，所以其研究及应用也发展迅速，但这些专利技术仍有些不足之处。姚硕、倪晋仁等人所进行的低温好氧反硝化菌的筛选方法(CN102061276B、CN102061277B、CN1020676433B、CN103342417B)，其起始反硝化底物(硝酸盐)浓度较高(100mg/L以上)，虽然最终降至20mg/L左右，但仍然远高于《地表水环境质量标准》GB3838-2002中V类水的标准，所分离得到的菌并不适合地表水环境的脱氮治理。相类似的，马放等人分离得到低温好氧反硝化菌较为适合反应器中高浓度硝酸盐的处理(CN1020690765B、CN102776140B)，对于污染物浓度较低的地表水体并不适用。张淑梅等人筛选低温脱氮菌的方法(CN103275908B)，采用冬季黑龙江省寒冷冬季的地表水体样品，虽然该方法可以缩短筛选时间，且菌种较为适合自然水体，但从采样时间(寒冷季节)及空间(高纬度地区)上来看，该方法都有极大的限制性，具有推广应用的局限性。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种能从常温环境中分离得到适合地表水环境脱氮处理的低温好氧反硝化菌的富集分离方法。为达到上述目的，本专利技术一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法，包括如下步骤，(1)制备底泥悬浊液和富集培养液，并将底泥悬浊液与富集培养液混合进行数轮的逐级降温富集培养获得低温的好氧反硝化菌群；(2)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基，对牛肉膏蛋白胨固体培养基进行高温灭菌处理并制得固体平板；(3)对步骤(1)中得到的好氧反硝化菌群进行单菌落分离，得到单菌落；并将得到的单菌落接种于步骤(2)中的灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并进行杜氏管产气检验，得到低温好氧反硝化菌株；(4)利用牛肉膏蛋白胨液体培养基对获得的低温好氧反硝化菌株进行发酵培养得到低温好氧反硝化菌液。进一步地，所述步骤(1)中富集培养的具体过程为：将底泥悬浊液添至含有富集培养液的培养瓶内，采用无菌过滤透气膜封口，并将所述培养瓶置于恒温摇床上，以120-200rpm，在15-25℃、避光的条件下进行富集培养，并获取培养后培养瓶中的沉淀物；将沉淀物添加至新鲜的富集培液中进行富集培养，反复进行4-6轮后得到好氧反硝化菌菌液；其中，在进行每轮富集培养时培养温度均低于前一轮的培养温度，且最后一轮的培养温度为4-10℃。进一步地，所述底泥悬浊液包括自然水体中的底泥悬浊液、污水处理厂的活性污泥悬浊液或者土壤悬浊液。进一步地，所述步骤(1)中富集培养基的制备方法具体为，将0.01-0.1g的硝酸钠、0.1-0.5g的乙酸钠、0.03-0.08g的磷酸二氢钾、0.01-0.07g的硫酸镁、0.01-0.1g的氯化钠和1000mL的水混合，搅拌得到富集培养液。进一步地，所述步骤(2)中，牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法为，将3.0g的牛肉膏，10.0g的蛋白胨，5.0g的氯化钠，15-25g的琼脂和1000mL水的混合获得混合物，将混合物置于高温灭菌锅内在121℃的温度下，灭菌20min后得到培养基。进一步地，所述步骤(2)中牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法为，将3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化钠和1000mL水混合，搅拌并进行高温灭菌处理得到液体培养基。进一步地，所述步骤(3)中制得单菌落的方法为，对步骤(2)中得到的好氧反硝化菌群进行平板划线处理并在4-10℃的温度下进行培养，得到单菌落。本专利技术低温好氧反硝化菌的富集分离方法，能够简便、高效的在常温环境中分离得到低温好氧反硝化菌；同时，该方法所得到的好氧反硝化菌群适应低温水体，可结合曝气等工艺下降解水体中硝酸盐浓度，较为适合自然水体的脱氮工程应用，且易于发酵扩大培养。为达到上述目的，本专利技术一种水体治理方法，包括按照上述的低温好氧反硝化菌的富集分离方法获得低温好氧反硝化菌菌液，将获得的低温好氧反硝化菌菌液添加至水体中，并对水体进行曝气处理。本专利技术通过低温好氧反硝化菌的富集分离方法获得的低温好氧反硝化菌液，能过对污染水体进行有效的治理，能降低污染水体中的总氮含量。附图说明图1是本专利技术低温好氧反硝化菌的富集分离方法流程图。具体实施方式下面结合说明书附图对本专利技术做进一步的描述。实施例1结合图1，本实施例中提供一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法，包括(1)制备底泥悬浊液；制备富集培养液：将0.01-0.1g的硝酸钠、0.1-0.5g的乙酸钠、0.03-0.08g的磷酸二氢钾、0.01-0.07g的硫酸镁、0.01-0.1g的氯化钠和1000g的水混合，搅拌得到富集培养液；培养基无需进行灭菌处理，向锥形瓶内加入适量的液体培养基，并添加底泥悬浊液，最后用无菌过滤透气膜封口；在恒温摇床上，以120-200rpm，在15-25℃的避光条件下进行富集培养，培养时间为3-10天；获取培养后锥形瓶底部的沉淀物，并将沉淀物转移至新的富集培养液中进行4-6轮富集培养，并且每轮逐渐降低培养温度，最终降至4-10℃，获得好氧反硝化菌菌液；(2)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备方法为，将3.0g的牛肉膏，10.0g的蛋白胨，5.0g的氯化钠，15-25g的琼脂和1000mL水的混合获得混合物，将混合物置于高温灭菌锅内在121℃的温度下，灭菌20min后得到培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法，其特征在于，包括如下步骤，(1)制备底泥悬浊液和富集培养液，并将底泥悬浊液与富集培养液混合进行数轮的逐级降温富集培养获得低温的好氧反硝化菌群；(2)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基，对牛肉膏蛋白胨固体培养基进行高温灭菌处理并制得固体平板；(3)对步骤(1)中得到的好氧反硝化菌群进行单菌落分离，得到单菌落；并将得到的单菌落接种于步骤(2)中的灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并进行杜氏管产气检验，得到低温好氧反硝化菌株；(4)利用牛肉膏蛋白胨液体培养基对获得的低温好氧反硝化菌株进行发酵培养得到低温好氧反硝化菌液。

【技术特征摘要】
1.一种低温好氧反硝化菌的富集分离方法，其特征在于，包括如下步骤，(1)制备底泥悬浊液和富集培养液，并将底泥悬浊液与富集培养液混合进行数轮的逐级降温富集培养获得低温的好氧反硝化菌群；(2)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基，对牛肉膏蛋白胨固体培养基进行高温灭菌处理并制得固体平板；(3)对步骤(1)中得到的好氧反硝化菌群进行单菌落分离，得到单菌落；并将得到的单菌落接种于步骤(2)中的灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，并进行杜氏管产气检验，得到低温好氧反硝化菌株；(4)利用牛肉膏蛋白胨液体培养基对获得的低温好氧反硝化菌株进行发酵培养得到低温好氧反硝化菌液。2.根据权利要求1所述的低温好氧反硝化菌的富集分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中富集培养的具体过程为：将底泥悬浊液添至含有富集培养液的培养瓶内，采用无菌过滤透气膜封口，并将所述培养瓶置于恒温摇床上，以120-200rpm，在15-25℃、避光的条件下进行富集培养，并获取培养后培养瓶中的沉淀物；将沉淀物添加至新鲜的富集培液中进行富集培养，反复进行4-6轮后得到好氧反硝化菌液；其中，在进行每轮富集培养时培养温度均低于前一轮的培养温度，且最后一轮的培养温度为4-10℃。3.根据权利要求1所述的低温好氧反硝化菌的富集分离方法，其特征在于，所述底泥悬浊液包括自然水体中的底泥悬浊液、污水处理厂的活性污泥悬浊液或者土壤悬浊液。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟溪，赵丹，骆守鹏，
申请(专利权)人：中冶华天工程技术有限公司，中冶华天南京工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34