一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用，所述免疫细胞冻存液组分包括：DMSO、丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠、人供体血浆；其重量比为：5％～15％DMSO、1％～5％丙二醇、2％～8％海藻糖、3％～8％甲基纤维素、0.3％～1.2％谷胱甘肽、0.06％～0.14％丙酮酸钠、60％～80％人供体血浆，冻存效果很好，能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，细胞生物学特性不发生变化，可应用于临床治疗；适用于人单个核细胞及其它各类免疫细胞的长期冷冻储存。

An immune cell cryopreservation solution, its preparation method, cryopreservation method and its application

The invention discloses a liquid, its preparation method, and application of freezing method for cryopreservation of a type of immune cell, liquid components including freezing the immune cells: DMSO, propylene glycol, trehalose, methyl cellulose, glutathione, sodium pyruvate, donor plasma; the weight ratio of 5% to 15%, 1%: DMSO ~ 5% propylene glycol, 2% ~ 8%, 3% ~ 8% trehalose methyl cellulose, 0.3% ~ 1.2%, 0.06% ~ 0.14% glutathione sodium pyruvate, 60% ~ 80% of cryopreserved donor plasma, the effect is very good, can effectively protect the immune cells from freezing injury, physiological function and biological characteristics of maintaining immune cells after resuscitation, biological characteristics the cell does not change, it can be used in clinical treatment; long-term freezing for mononuclear cells and other types of immune cell storage.

【技术实现步骤摘要】
一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用
本专利技术属于细胞保存
，特别涉及一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用。
技术介绍
近年来肿瘤和病毒的免疫治疗技术已经慢慢的应用到了临床。如肿瘤疫苗和过继免疫疗法，这些方法主要是通过自体的免疫细胞经体外刺激、培养、扩增然后回输来提高患者的免疫力，目前该类细胞主要有树突状细胞(DC)，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，自然杀伤细胞(NK)，树突状细胞诱导的杀伤细胞(DC-CIK)，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)等。这些经诱导和扩增培养的免疫细胞，它的初始细胞来源都是外周血或脐血的单个核细胞，而且是直接分离培养。随着年龄的增长，免疫细胞在体内的活性也会随之降低，所以在年轻时期冻存具有较高活性的免疫细胞，对于未来罹患肿瘤相关疾病的治疗可以起到很好的保障，而且从健康养生的角度来看，也可以在患者本人健康时提取从其外周血中提取免疫细胞，并在以后患者本人出现免疫低下或其他症状时，可以将存储的免疫细胞活化、扩增后回输给患者本人，提高患者的免疫力，因此，保存免疫细胞在基础临床和临床研究上具有重要意义。目前，细胞冷冻技术是保存细胞的主要方法之一，尤其对供体的免疫细胞深低温保存可以维持其活力。目前国内常采用的冻存液基本是DMSO、人供体血清，免疫细胞基础培养基，如CN104026118A公开了一种免疫细胞冻存液、其制备方法及应用，该免疫细胞冻存液按体积百分比由10％二甲基亚砜、10％人供体血浆和80％opTmizerTMCTSTMT-CellExpansionSFM培养基组成，该免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响，但该冷冻液的免疫细胞存活率低。也有将DMSO代替的细胞冻存液，如CN105638642A公开公开一种免疫细胞冻存液及其应用，一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其包括以下组分：重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠，该细胞冻存液将聚乙二醇、1,2-丙二醇代替DMSO，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。由于基础临床研究和临床上对免疫细胞的需求量大，因此研究免疫细胞复苏后细胞存活率高、细胞增殖活性好的冻存液及冻存方法具有非常大的意义。
技术实现思路
鉴于上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的提供了一种免疫细胞冻存液、冻存方法及应用，能够使免疫细胞复苏后免疫细胞存活率高、免疫细胞增殖性好。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现：一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液组分包括：DMSO、丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠、人供体血浆；其重量比为：5％～15％DMSO、1％～5％丙二醇、2％～8％海藻糖、3％～8％甲基纤维素、0.3％～1.2％谷胱甘肽、0.06％～0.14％丙酮酸钠、60％～80％人供体血浆。上述的一种免疫细胞冻存液，其中，所述免疫细胞冻存液组分包括：8％～12％DMSO、2％～4％丙二醇、3％～6％海藻糖、4％～7％甲基纤维素、0.5％～1％谷胱甘肽、0.08％～0.12％丙酮酸钠、74％～78％人供体血浆；优选地，10％DMSO、3％丙二醇、5％海藻糖、6％甲基纤维素、0.8％谷胱甘肽、0.1％丙酮酸钠、75.1％人供体血浆。上述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述甲基纤维素为甲基纤维素1500cp。一种免疫细胞冻存液的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：(1)制备人供体血浆；(2)按重量比称取各组分，将称取的丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠和人供体血浆先混合均匀，再立即与DMSO混合，过滤，2-8℃预冷，即得所述免疫细胞冻存液。上述免疫细胞冻存液的制备方法，其中，步骤(1)所述制备人供体血浆的方法：通过将抗凝外周血离心，吸取上层血浆，水浴，离心弃沉淀，即获得所述人供体血浆。优选地，将所述抗凝外周血低速离心，2000-2500rpm,7min；吸取上层血浆，上层血浆56℃水浴30min；然后15000rpm离心5min弃沉淀，即获得所述人供体血浆。肝素抗凝的血浆低速离心后，在冻融时可能会出现沉淀，进而影响冻存复苏后细胞收集，而本专利技术在获得人供体血浆中采用15000rpm，5min这一高速离心能有效避免这一问题。一种免疫细胞的冻存方法，其中，包括：(a)获取免疫细胞；(b)免疫细胞混悬液制备：将所述免疫细胞冻存液2-8℃预冷，缓慢加入到步骤(a)的免疫细胞里，混匀，即得所述免疫细胞混悬液；(c)将所述免疫细胞混悬液依次在4℃放置40-50min，-20℃放置30-60min，-80℃放置12h-15h，置于液氮中保存。本专利技术所述免疫细胞混悬液制备过程中，将所述免疫细胞冻存液预先于2-8℃预冷，以降低DMSO溶于冻存液时升温对细胞的损伤。上述的一种免疫细胞的冻存方法，其中，步骤(c)将所述免疫细胞混悬液依次在4℃放置40min，-20℃放置30min，-80℃放置12h，最后置于液氮中保存。上述的免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。上述的一种免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用，其中，所述免疫细胞为人单个核细胞及各类免疫细胞，优选地，CIK细胞或NK细胞。本专利技术提供的一种免疫细胞冻存液，其中DMSO和丙二醇属于渗透性细胞膜内保护剂，在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩；海藻糖，是一种安全、可靠的天然糖类，由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；甲基纤维素属于大分子糖类，增加溶剂的粘度，可以作为细胞沉降稳定剂；谷胱甘肽是还原剂，作为抗氧化剂；丙酮酸钠作为碳源，添加少量作为细胞营养剂；人供体血浆作为溶剂，不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响。与现有技术相比，本专利技术所提供的一种免疫细胞冻存液、其制备方法、冻存方法及应用，达到了如下技术效果：1)提供了一种全新组分的免疫细胞冻存液，其具有成本、经济、简单、方便的优点；2)本专利技术免疫细胞冻存液冻存效果很好，能够有效的保护免疫细胞免受冷冻损伤，保持免疫细胞复苏后的生理功能和生物学特性，细胞生物学特性不发生变化，可应用于临床治疗；3)本专利技术的免疫细胞冻存液适用于人单个核细胞及其它各类免疫细胞的长期冷冻储存，适用于免疫细胞的高密度冻存。4)本专利技术的免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，不会对人体过继免疫治疗产生影响；5)与进口免疫细胞冻存液相比，成本低，廉价；6)与传统的免疫细胞冻存液相比，免疫细胞的复苏率高，免疫细胞增殖活性高，可以长时间保存；7)肝素抗凝的血浆低速离心后，在冻融时可能会出现沉淀，进而影响冻存复苏后细胞收集，而本专利技术采用地高速离心能有效避免这一问题。以下便结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详述，以使本专利技术技术方案更易于理解、掌握。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液组分包括：DMSO、丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠、人供体血浆；其重量比为：5％～15％DMSO、1％～5％丙二醇、2％～8％海藻糖、3％～8％甲基纤维素、0.3％～1.2％谷胱甘肽、0.06％～0.14％丙酮酸钠、60％～80％人供体血浆。

【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞冻存液，所述免疫细胞冻存液组分包括：DMSO、丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠、人供体血浆；其重量比为：5％～15％DMSO、1％～5％丙二醇、2％～8％海藻糖、3％～8％甲基纤维素、0.3％～1.2％谷胱甘肽、0.06％～0.14％丙酮酸钠、60％～80％人供体血浆。2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液组分包括：8％～12％DMSO、2％～4％丙二醇、3％～6％海藻糖、4％～7％甲基纤维素、0.5％～1％谷胱甘肽、0.08％～0.12％丙酮酸钠、74％～78％人供体血浆；优选地，10％DMSO、3％丙二醇、5％海藻糖、6％甲基纤维素、0.8％谷胱甘肽、0.1％丙酮酸钠、75.1％人供体血浆。3.根据权利要求1或2所述的一种免疫细胞冻存液，其特征在于，所述甲基纤维素为甲基纤维素1500cp。4.一种根据权利要求1或2所述免疫细胞冻存液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)制备人供体血浆；(2)按重量比称取各组分，将称取的丙二醇、海藻糖、甲基纤维素、谷胱甘肽、丙酮酸钠和人供体血浆先混合均匀，再立即与DMSO混合，过滤，2-8℃预冷，即得所述免疫细胞冻存液...

【专利技术属性】
技术研发人员：何跃，麦志国，肖秀丽，袁静娜，何炳坤，李维维，李结珍，来从显，
申请(专利权)人：广州市金航生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44