类固醇的微生物9α-羟基化制造技术

描述了一种构建类固醇降解微生物的遗传修饰菌株的方法，其中参与类固醇核降解的多个基因，例如类固醇脱氢酶基因被失活。这些基因的例子是ｋｓｔＤ１和ｋｓｔＤ２。有多个失活的类固醇降解酶基因的菌株能用于高产率积累类固醇中间体，一种优选的积累产物是９α－羟基－４－雄烯－３，１７－二酮。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制备对类固醇核降解有抑制作用的经遗传工程修饰的微生物的方法，这种微生物在类固醇积累中的应用以及这种经修饰的微生物。降解植物甾醇的能力广泛存在于诺卡菌形放线菌中，这一能力需要一组能降解侧链和类固醇核结构的酶。3-酮类固醇Δ1-脱氢酶(KSTD)通过在C1-C2位置引入一个双键而参与类固醇核的B环的裂解。更特别地，该酶参与4-雄烯-3，17-二酮至1，4-雄二烯-3，17-二酮的转化，以及9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮至9α-羟基-1，4-雄二烯-3，17-二酮的转化(见附图说明图1)。在几种细菌中鉴定了该酶简单节杆菌(Arthrobacter simplex)(Penasse and Peyre，1968Rhodococcus.Crit Rev Biotech 1429-73)，假单胞菌属(Pseudomonas)(Levy and Talalay，1959 J Biol Chem 2342009-20013；1959 J Biol Chem 2342014-2021)，局限诺卡氏菌(Nocardiarestrictus)(Sih and Bennet，1962 Biochem Biophys Acta56587-592)，珊瑚诺卡氏菌(Nocardia corallina)(Itagaki等人.，1990 Biochim Biophys Acta 103860-67)，不透明诺卡氏菌(Nocardiaopaca)(Drobnic等人.，1993 Biochim Biophys Res Comm190509-515)，偶发节杆菌(Mycobacterium fortuitum)(Wovcha等人.，1979 Biochim Biophys Acta 574471-479)和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)IMET7030(Kaufmann等人.，1992 JSteroid Biochem Molec Biol 43297-301)。不透明诺卡氏菌的KSTD被鉴定为一种黄素蛋白质(Lestrovaja等人.，1978 Z Allg Mikrobiol18189-196)。只有简单节杆菌、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonasrestosteroni)和紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)中编码KSTD的基因(kstD3-酮类固醇Δ1-脱氢酶)的性质得到充分地鉴定(Plesiat等人.，1991 J Bacteriol 1737219-7227；Molnar等人.，1995 Mol Microbiol 15895-905；Morii等人.，1998 J Biochem1241026-1032)。类固醇1，2-脱氢酶专有的抑制作用引起9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮的积累，后者是肾上腺皮质素合成的极好的起始物(Kieslich K，1985 J Basic Microbil 25461-474)。9α-羟基雄激素作为抗雄激素、抗雌激素和抗受精物质在工业上具有重要意义。9α-羟基很容易脱水形成9(11)-脱氢系统，从而为9α-卤代肾上腺皮质素生成提供起始结构。众所周知，红球菌(Rhodococcus)菌种有巨大的分解代谢潜力(Warhurst and Fewson，1994 Rhodococcus.Crit Rev Biotech1429-73；Bell等人.，1998 J Appl Microbiol 85195-210)。几种红球菌能降解天然植物甾醇，后者是生成有生物活性的类固醇的便宜起始物(Kieslich K，1986 Drug Res 36888-892)。红球菌和节杆菌属菌株在经诱变剂处理和/或与酶抑制剂孵育后，能将固醇转化成4-雄烯-3，17-二酮和1，4-雄二烯-3，17-二酮(Martin，1977 Adv ApplMicrobiol 2229-58)。尽管kstD的克隆和红串红球菌IMET7030的无活性KSTD蛋白质在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达已有描述(Wagner等人.，1992J Basic Microbiol 3265-71；1992 J Basic Microbiol 32269-277)，并且不透明诺卡氏菌(Drobnic等人.，1993 Biochem Biophys Res Comm190509-515)的一段核苷酸序列可以获得(DDBJ/EMBL/GenBankU59422)，但是该基因分子鉴定方面没有报道。KSTD活性对类固醇核降解是必要的，并且kstD基因的失活对积累类固醇中间体是必需的。根据本专利技术的一个方面，提供了红串红球菌的kstD基因的核苷酸序列。KSTD蛋白质由SEQ ID NO1的核苷酸820-2329编码。使基因失活是分析基因功能和引入代谢阻碍的有力工具。用带有选择标记的非复制性载体破坏基因是使基因失活的一种常用方法。然而，用代谢途径工程方法构建具有所需特征的菌株可能需要分步骤使数个基因失活或取代。只有具有合适的策略，可用于引入未被标记的基因缺失或基因取代，能够进行无限轮代谢加工而不依赖于多个标记的使用，才能使之可行。根据本专利技术的另一个方面，提供了分步失活参与类固醇降解的基因，优选脱氢酶基因的方法。特别地，本专利技术可应用于对参与了通过在4-雄烯-3，17-二酮上培养微生物而积累9α-羟基-4-雄烯-3，17-二酮的过程的基因进行灭活。优选地，至少使基因kstD1失活。意外地发现，破坏红串红球菌SQ1中编码3-酮类固醇Δ1-脱氢酶的基因kstD1，并没有导致类固醇核降解的失活。保留的活性似乎是基于另一个酶的存在。现已发现，超过一个基因的失活对获得完全阻断类固醇核降解的菌株是必需的。优选第二个酶是脱氢酶，更优选的是KSTD同工酶。为了有可能破坏或缺失某些基因，一个优选的方法是定点诱变。对于分步骤失活KSTD基因而言，优选引入未标记的基因缺失的方法。所产生的遗传上被改造的菌株应是不含外源DNA的。根据本专利技术的另一个优选方案，至少使基因kstD2失活。最优选地，至少使基因kstD1和kstD2都失活。本专利技术的另一个方面是红串红球菌的kstD2基因的核苷酸序列。KSTD2蛋白质是由SEQ ID NO5的核苷酸1-1678编码。在红球菌属中引入未被标记的基因缺失的方法还没有报道。然而，在放线菌目的另一些成员中，即链霉菌属(Streptomyces)(Hillemann等人.，1991 Nucleic Acid Res 19727-731；Hosted和Baltz，1997J.Bacteriol 179180-186)，棒杆菌属(Corynebacterium)(Schafer等人，1994 Gene 14569-73)和节杆菌属(Marklund等人，1995 JBacteriol 1776100-6105；Morman等人，1995 Mol Microbiol16755-760；Sander等人，1995 Mol Micorbiol 16991-1000；Pelicic等人，1996 Mol Microbiol 20919-125；Kinpfer等人本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建类固醇降解微生物缺乏降解类固醇核的能力的经遗传修饰菌株的方法，包括使多个参与类固醇核降解的基因失活。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R范德盖兹，G赫塞尔斯，L迪杰奎兹恩，
申请(专利权)人：阿克佐诺贝尔公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]