人体心肌肌钙蛋白Ⅰ的纯化和其单克隆抗体的制备方法技术

人体心肌肌钙蛋白Ⅰ的纯化和其单克隆抗体制备方法，其特征在于包含如下步骤：　　　　（１）取人体新鲜或速冻冷藏的心肌组织，去脂肪及纤维，经匀浆、离心、沉淀、抽提、高盐溶解等步骤处理后，在层析介质为ＣＭＳｅｐｈａｄｅｘ－Ｃ５０、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ＤＥ５２，缓冲体系为Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ值为７．２～７．８，尿素含量为６～８ｍｏｌ／Ｌ条件下依次进行层析，分别收集含心肌肌钙蛋白Ｃ（ｃＴｎＣ）和心肌肌钙蛋白Ｉ（ｃＴｎＩ）的蛋白峰；　　　　（２）取上述步骤（１）所得心肌肌钙蛋白Ｃ，在偶联溶液为０．１～０．３ｍｏｌ／Ｌ　　ＮａＨＣＯ↓［３］，ｐＨ值为７．８～８．５，３～６ｍｍｏｌ／Ｌ　　ＣａＣｌ↓［２］，平衡缓冲液为４５～５５ｍｍｏｌ／Ｌ　　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，８～１０ｍｏｌ／Ｌ尿素，０．８～１．２ｍｍｏｌ／Ｌ　　ＣａＣｌ↓［２］，１２～１８ｍｍｏｌ／Ｌ　　β巯基乙醇，ｐＨ值为７．８～８．２的条件下与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　４Ｂ亲和层析柱相偶联，制备成Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　４Ｂ亲和层析柱；　　　　（３）取上述步骤（１）经ＣＭ　　Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｃ５０层析后的粗提品的心肌肌钙蛋白Ⅰ峰收集液，再加入步骤（２）所得Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ亲和层析柱进行亲和层析，即得纯化的心肌肌钙蛋白Ⅰ；　　　　（４）取上述步骤（３）所制得的心肌肌钙蛋白Ⅰ，多次注入ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔免疫小鼠，间隔时间为２～３周，至小鼠血清抗心肌肌钙蛋白Ⅰ抗体滴度大于１∶２０００，取小鼠脾细胞和ＳＰ２／０骨髓瘤细胞；　　　　（５）将上述步骤（４）的二种细胞混匀，加入ＤＭＥＭ无血清培养液处理，再加入含１５～２０％胎牛血清的ＨＡＴ培养液，置培养箱培养，进行细胞融合；　　　　（６）取上述步骤（５）的培养液上清，用ＥＬＩＳＡ法检测培养液中的杂交瘤细胞，即心肌肌钙蛋白Ⅰ的特异性抗体；　　　　（７）取上述步骤（６）检测出的杂交瘤细胞采用有限稀释法培养，制得增殖的同源性细胞克隆，即单克隆细胞株。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种亲和层析法纯化人体心肌肌钙蛋白I的方法和制备该心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体的方法以及一步法测定其含量的方法。
技术介绍
心肌缺血性损伤，特别是急性心肌梗死(AMI)是威胁人类生命的主要疾病之一。临床上一直在努力寻找特异性好、灵敏度高的血清指标，以对其进行诊断。目前，肌酸激酶同工酸(CK-MB)已用作诊断心肌梗死的重要指标，但CK-MB并非心脏特有，正常人的骨骼肌中也少量存在，横纹肌源性疾病则更多，非心脏手术或骨骼肌损伤病人常有CK-MB增高，易造成AMI诊断假阳性。近年来的研究表明，心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)具有高度的心肌特异性，当心肌细胞受损时，血液中cTnI出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关。它可作为心肌损伤的一种特异性指标，对心脏病的诊断有十分重要的意义。因此，对人体心肌肌钙蛋白I进行纯化并寻找其相应的抗体，用于对心脏病人的诊断以成为当今心脏病诊断研究的前沿学科。1999年欧洲和世界临床化学协会(IFCC)已经提出将心肌肌钙蛋白I(cTnI)作为诊断AMI的指标。目前，对心肌肌钙蛋白I的提取大多采用动物提取，尚没见利用人体心肌提取的报道，如Bodor GS(Bodor GS，Porter S，Landt Y，et al.The development of monoclonal antibodies and an assay for cardiactroponin I with preliminary results in suspected myocardialinfarction.Chin Chem，1992；382203-2214)、Thulin E(Thulin E，VogelHJ.Purification of rabbit skeletal muscle troponin C.Clin Chem Acta，1988；211-215)、Syska H(Syska H，Perry SV，Trayer.A new method ofpreparation of troponin I using affinity chromatography.FEBS Letters，1974；40253-257)、Pharmacia LKB Biotechnology Ltd Co(Affinitychromatography principle and methods.1988，p15，Sweden)等的文献对提取心肌肌钙蛋白I都有报道。但其利用动物提取，主要缺点是同源性差，用于培育产生心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体，其特异性较差，敏感性较差。用于对心脏病的诊断准确率仍有待提高。目前，用心肌肌钙蛋白I制备其抗体，大多用动物心肌组织提取心肌肌钙蛋白I制备其单抗或多抗抗体。Cummins等(Cummins P，Young A，Auckand ML，et al.Comparison of serum cardiac specifictoponin I with creatine kinase，creatine kinase MB isoenzyme，tropomyosin，myoglobin and C reactive protein release in marathonrunnerscardiac or skeletal muscle trauma？Eur J Clin Invest，1987；17317)于1987年首先用心肌肌钙蛋白I给兔和羊注射后，培育和制备了心肌肌钙蛋白I的多克隆抗体，并以核素碘标记。建立了放射免疫法对心肌肌钙蛋白I的定量测量。采用动物制备单克隆抗体，用于检测人体心肌肌钙蛋白I的含量，主要存在抗体同源性差，特异性、敏感性较差的缺陷，还不能使心脏病诊断的准确率进一步提高。目前，对于心脏疾病的患者的心肌肌钙蛋白I的含量检测，有定性、半定性和定量三种方法。由于单克隆抗体的来源不同，参照值不完全一致。测定原理主要以各种免疫酶检测法与放射免疫检测为主。国外主要通过免疫酶检测法，利用自动化分析仪来完成(如Status、Access等自动化分析仪)，可在1小时内出结果，但需要购买涂有抗体的醋纤膜等配套试剂，且该类试剂价格昂贵。也有采用ELISA双夹心定量法检测的，但该法一般用手工系统操作，需较长时间，不利于对疾病患者争取宝贵的诊断治疗时间。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用亲和层析法纯化人体心肌肌钙蛋白I的方法，以及利用该心肌肌钙蛋白I制备其单克隆抗体的方法。同时提供一种利用由该方法获得的心肌肌钙蛋白I及单克隆抗体建立一步法快速测定心脏病患者心肌肌钙蛋白I含量的方法。本专利技术的目的是通过如下技术解决方案实现的(一)依据本专利技术，人体心肌肌钙蛋白I的纯化方法如下(1)取人体新鲜或速冻冷藏的心肌组织，去脂肪及纤维，经匀浆、离心、沉淀、抽提、高盐溶解等步骤处理后，在层析介质为CMSephadex-C50、Cellulose-DE52，缓冲体系为Tris-HCl，pH值为7.2～7.8，尿素含量为6～8mol/L条件下依次进行层析，分别收集含心肌肌钙蛋白C(cTnC)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)的蛋白峰； (2)取上述步骤(1)所得心肌肌钙蛋白C，在耦联溶液为0.1～0.3mol/L NaHCO3，pH值为7.8～8.5，3～6mmol/L CaCl2，平衡缓冲液为45～55mmol/L Tris-HCl，8～10mol/L尿素，0.8～1.2mmol/LCaCl2，12～18mmol/Lβ巯基乙醇，pH值为7.8～8.2的条件下与Sepharose 4B亲和层析柱相耦联，制备成Sepharose 4B亲和层析柱；(3)取上述步骤(1)经CM Sephadex-C50层析后的粗提品的心肌肌钙蛋白I峰收集液，再加入步骤(2)所得Sepharose 4B亲和层析柱进行亲和层析，即得纯化的心肌肌钙蛋白I。(二)依据本专利技术，人体心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体制备方法如下(1)取前述(一)所制得心肌肌钙蛋白I，多次注入BALB/c小鼠腹腔免疫小鼠，间隔时间为2～3周，至小鼠血清抗心肌肌钙蛋白I抗体滴度大于1∶2000，取小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞；(2)上述步骤(1)的二种细胞混匀，加入DMEM无血清培养液处理，再加入含15～20％胎牛血清的HAT培养液，置培养箱培养，进行细胞融合；(3)取上述步骤(2)的培养液上清，用ELISA法检测培养液中的杂交瘤细胞，即心肌肌钙蛋白I的特异性抗体；(4)上述步骤(3)检测出的杂交瘤细胞采用有限稀释法培养，制得增殖的同源性细胞克隆，即单克隆细胞株；(5)将上述步骤(4)制得的单克隆细胞株，与标准单克隆抗体2B1.9、2F6.6进行对照，采用Western blot及ELISA法测定，检测出抗心肌肌钙蛋白I捕捉单克隆抗体IgG1(联有辣根过氧化物酶的单克隆抗体)和抗心肌肌钙蛋白I标记生物素抗体IgG2b(联有生物素的单克隆抗体)，上述二单克隆抗体即为本方法所得的具有高特异性、高敏感性的心肌肌钙蛋白I的单克隆抗体。(三)依据本专利技术，人体心肌肌钙蛋白I的一步法快速测定方法如下(1)用50～150本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张寄南，苏恩本，
申请(专利权)人：上海润东生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：