编码重组的来源于巨型艾美球虫子孢子/裂殖子的250kDa抗原的核酸,和它们的应用制造技术

本发明专利技术提供分离的核酸或其互补序列，该核酸包含编码来自巨型艾美球虫子孢子／裂殖子的２５０ｋＤａ多肽，或编码该多肽同源物的核苷酸序列，和产生它的重组２５０ｋＤａ多肽的方法。提供分离的核酸或其互补序列，该核酸包含编码具有此处的氨基酸序列、来自巨型艾美球虫子孢子／裂殖子２５０ｋＤａ多肽的免疫显性部分，或编码该多肽同源物的核苷酸序列。提供抗柔嫩艾美球虫，巨型艾美球虫，堆型艾美球虫，扁嘴艾美球虫，早熟艾美球虫，缓艾美球虫或布氏艾美球虫，或表达免疫交叉反应性抗原的微生物的疫苗及免疫受试者以抗它们感染的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,和它们的应用的制作方法本申请要求2001年7月6日提交的美国临时申请号60/303,670的利益，该申请的内容因此通过参考结合于本申请。贯穿本申请，在括号中参考了各种出版物。在说明书的结尾紧接着权利要求之前可以发现以字母顺序列出的这些出版物的完整引用。这些出版物它们的全部公开内容因此通过参考结合于本申请以便更充分地描述本专利技术所属领域的状况。
技术介绍
在鸡中导致被称为“球虫病”的疾病的生物属于顶复门(phylumApicomplexa)，孢子纲，球虫亚纲，真球虫目(order Eucoccidia)，艾美球虫亚目(suborder Eimeriorina)，艾美球虫科(family Eimeriidae)，艾美球虫属(genus Eimeria)。在艾美球虫属内存在许多的种，其中几种在鸡中是致病的。对于鸡产业主要关注的物种是柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)，巨型艾美球虫(Eimeria maxima)，堆型艾美球虫(Eimeria acervulina)，扁嘴艾美球虫(Eimeria necatrix)和布氏艾美球虫(Eimeria brunetti)。在过去的几十年中，球虫病已经成为鸡产业中的主要经济问题，主要是由于鸡场的过度拥挤和寄生虫抗药性的发展。在干草地面上的拥挤条件下饲养鸡为艾美球虫属寄生虫的生长和传播提供了最适的条件。在该情形下，卫生控制是不可能的，农民必须依靠抑球虫剂药物的效力。然而，必须将药物一直保持在饲料中，必须使用穿梭计划(shuttle program)以避免艾美球虫属的耐药品系出现，并且某些药物具有昂贵的副作用。另外，这些抑球虫剂还具有抗菌效果并因此被认为是进料(in-feed)抗生素。最近欧盟已经决定在鸡产业中禁止使用包括抗球虫药的所有进料抗生素。因此，未来控制球虫病的唯一可行方法是通过疫苗开发。艾美球虫属寄生虫在肠道的粘膜中经历复杂的生活周期。除了缺乏节肢动物媒介，该生活周期与其它血孢子虫寄生虫(即疟原虫属，巴贝虫属等)非常相似。卵囊在干草地面上形成孢子，产生4个孢囊，每个包含2个子孢子(因此属于孢子纲)。卵囊被鸡摄食，孢囊通过砂囊的机械研磨释放。然后，由于在肠内蛋白水解酶消化孢囊壁，子孢子从孢囊释放。然后可移动的子孢子侵入淋巴细胞并继续侵入上皮细胞，在那里开始无性生殖周期。寄生虫经历2-4个复制和分裂周期(每个物种具有确定的分裂数)，导致大量子裂殖子的产生。在裂殖子产生的末循环之后开始性周期，产生大配子母细胞(雌性)和小配子母细胞。大配子母细胞其特征在于成壁体(wall forming bodies)的产生，而小配子母细胞包含涉及小配子的形成的组分，小配子从胞内寄生虫的表面出芽。小配子是有鞭毛的并负责大配子的受精。形成合子，其通过成壁体的融合和细胞核的浓缩成熟为卵囊。卵囊分泌在粪便中，从而完成循环。在过去几年中，已经使用源于巨型艾美球虫的性(配子母细胞)阶段的天然抗原来免疫产卵的母鸡。子代鸡因此通过母体免疫(保护性母体抗体)接种。在巨型艾美球虫的配子母细胞中先前已经鉴定3种主要的保护性抗原，其具有250，82和56kDa的分子量(欧洲专利号0 256 536，美国专利号5,496,550，和美国专利号5,932,225)。欧洲专利号0 256 536，美国专利号5,496,550，和美国专利号5,932,225因此通过参考结合到本专利技术中以便更充分地描述本专利技术所属领域的状况。已经显示这些抗原在艾美球虫属的物种之间是很保守的(Wallach 1995)并且可以交叉保护免遭在肉用仔鸡中导致球虫病的3种主要物种-巨型艾美球虫，柔嫩艾美球虫和堆型艾美球虫的侵袭。新近，显示在地面围栏试验(floor pen trials)中，源自用这些天然配子母细胞抗原接种的母鸡的小鸡在野外条件下被保护免遭艾美球虫属侵袭(Wallach 1996)。该保护的作用为将卵囊释放的峰值降低到对肉用仔鸡的性能不导致任何破坏作用的水平。基于上述结果得出结论，这些抗原对鸡的球虫病有效并有可能用于防止包括火鸡，鹅，羊，牛，猪和鱼的其它家畜的球虫病。这3种抗原特征还在于分子水平。进行无细胞翻译实验以鉴定编码它们的RNA分子(Mencher等)。通过免疫筛选在表达载体λzap中制备的cDNA文库来克隆编码这些抗原的cDNA分子(4，美国专利号5,932,225)。通过该方法，克隆和部分测序了编码250kDa抗原的基因。在美国专利号5,932,225和5,496,550中部分测序了克隆pEM 250/14。本申请的图8a复制美国专利号5,932,225和5,496,550的附图说明图11，其描绘了克隆pEM 250/14开始的293个核苷酸的DNA序列。本申请的图8b复制美国专利号5,932,225和5,496,550的图12，其显示了克隆pEM 250/14最后的196个核苷酸的DNA序列。此外，在美国专利号5,932,225和5,496,550中，克隆和测序了推定的编码56和82kDa抗原的基因。随后，Fried等将整个pEM 250/14克隆测序并发现抗原具有230kDa的分子量而不是以前所认为的250kDa。Fried等发现230kDa基因包含高度重复的基序并且贯穿整个基因包含这些重复(Fried等)。使用pATH质粒载体在细菌中表达该克隆，显示它被在感染巨型艾美球虫14天后采取的恢复期的鸡血清识别。最后，显示该基因只在大配子母细胞阶段表达，并通过免疫荧光发现位于大配子的成壁体中(Fried等)。通过使用针对56kDa抗原的多克隆抗体以及单克隆抗体筛选文库还获得编码56和82kDa抗原的cDNA克隆。先前显示该单克隆抗体给幼鸡提供被动免疫(Wallach 1990)。获得并分析几个克隆。发现克隆中的一个编码10kDa的小抗原，因此不是所需克隆。发现另一个克隆只包含可读框(ORF)的一小部分，并通过RNA印迹法显示与对于56和82kDa抗原差不多期望大小的两条mRNA杂交。因此得出结论这是所需克隆。然后筛选基因组文库以获得全长克隆。然而，由于在该克隆中高度重复的GCA基序，不可能特异性地分离全长克隆。由于这些重复导致克隆全长cDNA分子的尝试也不成功。最后，可能由于它们的异常序列在细菌中表达部分cDNA克隆的尝试也失败了，未获得合理的基因表达水平。先前已经显示56和82kDa抗原是糖基化的(美国专利号5,932,225)。这是基于它们与大豆凝集素的强烈反应性。因此，可能需要糖基化作用以便获得这些基因的良好表达和基因产物的正确构象。除了56，82和230kDa抗原以外，从高度纯化的卵囊壁的级分中获得的14kDa抗原已经被提议作为防止球虫病的疫苗的可能候选物(Eschenbacher等)。然而，该假说没有被研究。几个实验室已经正在研究针对球虫病的亚单位疫苗。这些研究人员大部分已经将它们的努力集中在生活周期的胞外无性繁殖阶段，特别是子孢子和裂殖子阶段，其被认为是最易受免疫攻击。在先前的研究中发现来自柔嫩艾美球虫的子孢子提取物可以在肉仔鸡中诱导针对该寄生虫的保护以防攻击感染达7周龄(Karkhanis等)。使用针对来源于柔嫩艾美球虫子孢子的抗原的单克隆抗体进行的工作导致25,000分子量抗原的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸或所述核酸的互补序列，所述分离的核酸包含编码来源于巨型艾美球虫的子孢子／裂殖子的２５０ｋＤａ多肽，或者编码所述多肽的同源物的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴维威特科姆里，尼古拉斯C史密斯，迈克尔瓦拉赫，
申请(专利权)人：ABIC特瓦生物实验室有限公司，悉尼理工大学，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]