一种编码加利车霉素生物合成的棘孢小单孢菌分离基因簇。所述生物合成基因簇含有编码蛋白和酶的基因，所述蛋白和酶用于含有芳基四糖和糖苷配基的加利车霉素的生物合成生产。所述基因簇还含有编码赋予加利车霉素抗性的蛋白的基因。本发明专利技术还提供生物合成簇的分离基因及其相应的蛋白。此外，本发明专利技术还涉及与加利车霉素基因簇杂交的ＤＮＡ和该簇的分离基因。还提供了含有生物合成基因及其功能性变体的基因的表达载体。本发明专利技术还涉及含有从棘孢小单孢菌加利车种基因组分离出来的ＤＮＡ的宿主细胞。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及棘孢小单孢菌加利车种(Micromonospora echinosporaspp.calichensis)的生物合成基因簇。特别是，含有编码用于加利车霉素的芳基四糖和糖苷配基的生物合成途径和构造中的蛋白和酶的基因的加利车霉素生物合成基因簇，且该基因赋予加利车霉素抗性。本专利技术还涉及生物合成簇的分离基因及它们相应的蛋白。此外，本专利技术涉及与加利车霉素基因簇杂交的DNA和该簇的分离基因。本专利技术还涉及含有生物合成基因簇，各个基因，或其功能性变体的表达载体。
技术介绍
烯二炔抗生素是80年代发现的，很长时间以来人们已经知晓了它们新的分子结构，显著的生物活性，及作用模式。烯二炔抗生素最初来源于微生物，包括小单孢菌，马杜拉放线菌，和链霉菌的发酵。Rothstein，D.M.，作为抗肿瘤剂的烯二炔抗生素，p.2(1995)。烯二炔抗生素被认为是已经发现的最有效且活性很高的抗肿瘤剂。Rothstein，D.M.，作为抗肿瘤剂的烯二炔抗生素，前言(1995)。迄今为止，人们已经发现这个抗生素家族的至少12个成员，大概分成2类。第一类烯二炔的成员是色素蛋白烯二炔，因为它们具有一种新的9元环发色团核心结构，为了使发色团稳定，它们还需要一种特殊的结合蛋白。烯二炔的第二类成员是非-色素蛋白烯二炔。这些烯二炔含有一个10元环，无需额外的稳定因子。这种烯二炔环状结构通常被称作“弹头”。这种弹头可导致DNA损坏，常常是双链裂解，而且可能不可修补。这种类型的DNA损坏对细胞通常是不可修补的，而且很可能是致命的。由于这些显著的化学和生物特性，为了研制新的和临床上有效的治疗性抗肿瘤剂，制药工业和学术界都在努力研究这些物质。9元环的色素蛋白烯二炔亚家族包括来源于抑癌链霉菌的新制癌菌素(Myers，A.G.等，J.Am.Chem.Soc.，110，7212-7214(1988))；来源于放线菌L585-6的kedarcidin(Leet，J.E.等，J.Am.Chem.Soc.，114，7946-7948(1992))；来源于球孢链霉菌的N1999A2(Yoshida，K.等，Tetrahedron Lett.，34，2637-2640(1993))；来源于马杜拉放线菌的maduropeptin(Schroeder，D.R.等，J.Am.Chem.Soc.，116，9351-9352(1994))；来源于链霉菌种AJ9493的N1999A2(Schroeder，D.R.等，J.Am.Chem.Soc.，116，9351-9352(1994))；来源于球孢放线菌的放线菌黄质(Khokhlov，A.S.等，J.Antibiot.，XXII，541-544(1969))；来源于浅多色链霉菌的广霉素(Yamaguchi，T.等，J.Antibiot.，XXIII，369-372(1970))；来源于大分子霉素链霉菌的auromomycin(Yamashita，T.等，J.Antibiot.，XXXII，330-339(1979))；和来源于假普通链孢囊菌的孢霉素(Komiyama，K.等，J.Antibiot.，XXX，202-208(1977))，据信它们全都具有生物活性所必需的新的二环dodecadiynene发色团核心结构。此外，除了N1999A2之外，一种必需的脱辅基蛋白质起稳定剂和特异性载体的作用，用于不稳定发色团，其转运和与靶DNA的相互作用。非-色素蛋白烯二炔亚家族包括来源于棘孢小单孢菌加利车种的加利车霉素；来源于Polysyncraton lithostrotum的namenamicin；来源于疣孢马杜拉放线菌的esperamicin；和来源于切氏小单孢菌的dynemicin。烯二炔抗生素具有作为抗癌剂的潜能是由于它们裂解DNA的能力；然而，在这些化合物中，有很多都因为毒性太大而不能用在临床研究中。目前，已知只有加利车霉素正在用于临床试验；而且作为一种抗癌剂，它已经提供了有价值的结果。例如，MyloTargTM，一种还可被称作CMA-676的加利车霉素-抗体偶联物已经于2000年1月由FDA批准用于治疗急性髓细胞白血病。如果可以控制烯二炔的毒性，那么它也可有效地用作抗感染剂。加利车霉素具有两个不同的结构区芳基四糖和糖苷配基(也称作弹头)。芳基四糖具有非常特殊的糖苷，硫酯，和羟胺键，并在可以接近那些序列时，在DNA的小沟内，主要起将药物递送到特殊序列段(5’-TCCT-3’和5’-TTTT-3’)的作用。然而，特异性也是依赖于环境的。加利车霉素的糖苷配基由高度官能化的二环tridecadiynene核心结构和作为触发机制的烯丙型三硫化物组成。McGahren，W.J.等，作为抗肿瘤剂的烯二炔抗生素，pp.75-86(1995)。一旦芳基四糖牢固对接，二环tridecadiynene核心结构经由1，4-苯炔双基芳构化，导致靶DNA的位点特异性氧化双链切开。Zein，N.等，Science，240，1198-1201(1988)。糖苷配基经历反应后产生碳居中的双基，其负责DNA裂解。加利车霉素的这种活性已经引起制药工业领域极大的兴趣，最近FDA已经批准使用加利车霉素-抗体偶联物MyloTargTM(CMA-676)治疗急性髓细胞性白血病(AML)。此外，相似策略已经在I期试验中用于治疗乳腺癌。近来还进行了大量规划来检验与选择性递送系统偶联的加利车霉素。Hamann，P.R.等，87thAnnual Meeting of the AmericanAssociation of Cancer Research，Washington，D.C.，pp.471(1996)；Hinman，L.M.等，Cancer Res.，53，3336(1993)；Hinman，L.M.等，作为抗肿瘤剂的烯二炔抗生素，pp.87-105(1995)；Sievers，E.L.等，Blood，93，3678-3684(1999)；Siegel，M.M.等，Anal.Chem.，69，2716-2726(1997)；Ellestad，G.个人通信。加利车霉素的生物活性及分子结构还促进了可能有效的类似物的研究。在生产合成类似物的众多实验室中，其中一组已经生产出了一种新的加利车霉素γI1，它可有效抑制鼠成神经细胞瘤同源模型中肝转移瘤的生长和扩散。Lode，H.N.等，Cancer Res.，58，2925-2928(1998)；Wrasidlo，W.等，Acta Oncologica，34，157-164(1995)。除了合成加利车霉素类似物外，还进行了棘孢小单孢菌的随机诱变，并筛选具有改进的生物合成潜能的突变株。Rothstein，D.M.，作为抗肿瘤剂的烯二炔抗生素，pp.107-126(1995)。加利车霉素的第一次完全合成是由Nicolaou及其同事在1992年报道的。然而，合成这种复合抗生素存在着许多缺点。例如，Nacelle’s过程的产率大约仅为0.007％，并需要47步。Halcomb，R.L.，作为抗肿瘤剂的烯二炔抗生素，pp.383-439(1995)。因此，加利车霉素的完全合成还是在从棘孢小单孢菌的大量发酵中分离出加利车霉素之后。因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来源于棘孢小单孢菌非色素蛋白烯二炔生物合成基因簇的分离核酸分子，包括所述核酸分子，编码一种或多种蛋白的所述核酸分子的一个或多个部分，编码一种或多种蛋白生物活性片段的所述核酸分子的一上或多个部分，来源于所述核酸分子的单链核酸分子，或来源于所述核酸分子一个或多个部分的单链核酸分子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：J托尔森，
申请(专利权)人：斯隆凯特林癌症研究所，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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