盐屋霉素的生物合成基因簇制造技术

本发明专利技术是一种由链霉菌产生的具有抗革兰氏阳性菌抗生素－盐屋霉素（Ｓｉｏｍｙｃｉｎ）的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含２１个基因：１０个与盐屋霉素大环生物合成相关基因，８个与侧链生物合成相关基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断盐屋霉素的合成。本发明专利技术所提供的基因及其蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗革兰氏阳性菌抗生素盐屋霉素(Siomycin)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。技术背景 盐屋霉素(Siomycin)是4种具有相似结构的硫肽类抗生素分子的统称，可由链霉菌Streptomyces sioyaensis ATCC13989所产生。1959年，人们首次从S.sioyaensis的发酵产物中提取出Siomycin的粗品，10年之后人们对粗品进行了进一步的纯化，发现它是由主要成分Siomycin A和其他几个微量的组分Siomyin B，C，D组成的。盐屋霉素的分子结构与硫链丝菌素十分相似，仅两个与喹萘啶酸相连的氨基酸残基稍有不同。它含有两个大环结构(分别为26员环和27员环)，4个噻唑环，1个噻唑啉，一个四取代的哌啶和一个喹萘啶酸结构，整个分子共有17个手性中心。前体标记实验表明其中噻唑、噻唑啉杂环来自于半胱氨酸，哌啶环由两个丝氨酸经酶催化后形成，喹萘啶酸由色氨酸衍生而来。 Siomycin对格兰氏阳性菌显示了很强的抗生素活性，在小鼠实验中也显示出显著的对肺炎球菌的抗性。但是，盐屋霉素水溶性不好，生物利用度较低，这大大限制了它的医药用途。人们希望能获得一些它的结构类似物，从中筛选出活性更好，更有利于实际使用的分子。由于盐屋霉素极其复杂的分子结构，即使是在有机合成化学高度发达的今天，通过化学全合成来获得产品也是一项艰巨的挑战。直到2008年才首次报道了盐屋霉素A的化学合成，整个合成过程操作繁琐，产率低下。通过化学合成所获得的结构类似物即使在活性和水溶性方面的性质得到改善，也可能因为合成的复杂性而使实际生产成本过高。 我们以微生物来源的盐屋霉素为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成机制的研究揭示了其经由核糖体合成的生物合成机制，并揭示了包括喹萘啶酸在内的独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰盐屋霉素的生物合成途径，探索水溶性好、生物利用度高、活性更好、并能通过微生物发酵大量生产的新型药物。
技术实现思路
本专利技术涉及一种由链霉菌Streptomyces sioyaensis ATCC13989产生的具有抗革兰氏阳性菌活性的抗生素——盐屋霉素(Siomycin)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。 本专利技术中整个基因簇共包含21个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中一个基因(sioH)负责编码盐屋霉素的前体肽，十个基因(sioO、sioM、sioJ、sioK、sioS、sioL、sioI、sioC、sioR、sioP)负责对sioH编码的前体肽进行后修饰，形成整个大环骨架；七个基因(sioF、SioA、SioE、SioB、SioD、SioU、SioP)负责以色氨酸为前体，合成喹萘啶酸结构单元；一个基因sioQ负责对形成的喹萘啶酸进行活化，在其他酶的催化作用下连接到大环骨架上，并最终形成分子中的第二个大环。 本专利技术还提供了一个编码氨基转移酶的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列组成，命名为sioA，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11552-10491碱基处。 本专利技术还提供了一个脂肪水解酶的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组成，命名为sioB，其基因的核苷酸序列位于序列1中第12421-11597碱基处。 本专利技术还提供了一个编码天门冬酰胺合成酶的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列组成，命名为sioC，其基因的核苷酸序列位于序列1中第14359-12500碱基处。 本专利技术还提供了一个编码酯环化酶的核苷酸序列，由序列5中的氨基酸序列组成，命名为sioD，其基因的核苷酸序列位于序列1中第14789-14382碱基处。 本专利技术还提供了一个编码酰基-CoA脱水酶的核苷酸序列，由序列6中的氨基酸序列组成，命名为sioE，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16066-14834碱基处。 本专利技术还提供了一个编码甲基转移酶的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序列组成，命名为sioF，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16974-16090碱基处。 本专利技术还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，由序列8中的氨基酸序列组成，命名为sioG，其基因的核苷酸序列位于序列1中第17554-17000碱基处。 本专利技术还提供了一个编码盐屋霉素前体肽的核苷酸序列，由序列9中的氨基酸序列组成，命名为sioH，其基因的核苷酸序列位于序列1中第17889-18074碱基处。 本专利技术还提供了一个编码水解酶的核苷酸序列，由序列10中的氨基酸序列组成，命名为sio I，其基因的核苷酸序列位于序列1中第18770-19555碱基处。 本专利技术还提供了一个编码脱水酶的核苷酸序列，由序列11中的氨基酸序列组成，命名为sioJ，其基因的核苷酸序列位于序列1中第19548-22196碱基处。 本专利技术还提供了一个编码脱水酶的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组成，命名为sioK，其基因的核苷酸序列位于序列1中第22193-23197碱基处。 本专利技术还提供了一个编码未知蛋白(可能负责催化D-A反应)的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为sioL，其基因的核苷酸序列位于序列1中第23194-24306碱基处。 本专利技术还提供了一个编码NADH依赖的氧化酶的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为sioM，其基因的核苷酸序列位于序列1中第24303-25967碱基处。 本专利技术还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为sioN，其基因的核苷酸序列位于序列1中第25964-27676碱基处。 本专利技术还提供了一个编码氮杂五元环环化酶的核苷酸序列，由序列16中的氨基酸序列组成，命名为sioO，其基因的核苷酸序列位于序列1中第27673-29616碱基处。 本专利技术还提供了一个编码细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命名为sioP，其基因的核苷酸序列位于序列1中第29594-30943碱基处。 本专利技术还提供了一个编码酰基-CoA合成酶的核苷酸序列，由序列18中的氨基酸序列组成，命名为sioQ，其基因的核苷酸序列位于序列1中第30919-32220碱基处。 本专利技术还提供了一个编码细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，由序列19中的氨基酸序列组成，命名为sioR其基因的核苷酸序列位于序列1中第32192-33424碱基处。 本专利技术还提供了一个编码脱水酶的核苷酸序列，由序列20中的氨基酸序列组成，命名为sioS，其基因的核苷酸序列位于序列1中第33412-36018碱基处。 本专利技术还提供了一个编码硫腺苷甲硫氨酸转移酶的核苷酸序列，由序列21中的氨基酸序列组成，命名为sioT，其基因的核苷酸序列位于序列1中第36030-37805碱基处。 本专利技术还提供了一个编码脱氢酶的核苷酸序列，由序列22中的氨基酸序列组成，命名为sioU，其基因的核苷酸序列位于序列1中第37802-38569碱基处。 序列1的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗革兰氏阳性菌活性的抗生素－盐屋霉素的生物合成基因簇，其特征在于编码盐屋霉素生物合成所涉及的２１个基因，具体为：　１）１个氨基转移酶基因，即ｓｉｏＡ：　ｓｉｏＡ位于基因簇核苷酸序列第１１５５２－１０４９１个碱基处，长度为１０ ６２个碱基对，氨基转移酶，３５３个氨基酸；　２）脂肪酶基因，即ｓｉｏＢ：　ｓｉｏＢ位于基因簇核苷酸序列第１２４２１－１１５９７个碱基处，长度为８２５个碱基对，编码脂肪酶，２７４个氨基酸；　３）天门冬酰胺合成酶基因，即：ｓｉ ｏＣ　ｓｉｏＣ位于基因簇核苷酸序列第１４３５９－１２５００个碱基处，长度为１８６０个碱基对，编码天门冬酰胺合成酶，６１９个氨基酸；　４）酯环化酶基因，即基因ｓｉｏＤ：　ｓｉｏＤ位于基因簇核苷酸序列第个１４７８９－１４３８２ 碱基处，长度为４０８个碱基对，编码酯环化酶，１３５个氨基酸；　５）酰基－ＣｏＡ脱氢酶基因，即ｓｉｏＥ：　ｓｉｏＥ位于基因簇核苷酸序列第１６０６６－１４８３４个碱基处，长度为１２３３个碱基对，编码酰基－ＣｏＡ脱氢酶，４１０个氨基酸 ；　６）甲基转移酶基因，即ｓｉｏＦ：　ｓｉｏＦ位于基因簇核苷酸序列第１６９７４－１６０９０个碱基处，长度为８８５个碱基对，编码甲基基转移酶，２９４个氨基酸；　７）具体功能未知的基因，即：ｓｉｏＧ：　ｓｉｏＧ位于基因簇 核苷酸序列第１７５５４－１７０００个碱基处，长度为５５５个碱基对，编码一个未知功能蛋白，１８４个氨基酸；　８）前体肽基因，即ｓｉｏＨ：　ｓｉｏＨ位于基因簇核苷酸序列第１７８８９－１８０７４个碱基处，长度为１８６个碱基对，编码Ｓｉ ｏｍｙｃｉｎ前体肽，６１个氨基酸；　９）水解酶基因，即ｓｉｏＩ：　ｓｉｏＩ位于基因簇核苷酸序列第１８７７０－１９５５５个碱基处，长度为７８６个碱基对，编码水解酶，２６１个氨基酸；　１０）脱水酶基因，即ｓｉｏＪ：　ｓｉ ｏＪ位于基因簇核苷酸序列第１９５４８－２２１９６个碱基处，长度为２６４９个碱基对，编码脱水酶，８８２个氨基酸；　１１）脱水酶基因，即ｓｉｏＫ：　ｓｉｏＫ位于基因簇核苷酸序列第２２１９３－２３１９７个碱基处，长度为１００５个碱基对 ，编码脱水酶，３３４个氨基酸；　１２）催化Ｄ－Ａ反应酶基因，即ｓｉｏＬ：　ｓｉｏＬ位于基因簇核苷酸序列第２３１９４－２４３０６...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，段炼，虞沂，廖日晶，雷春，丁莹，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]