一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法技术

本发明专利技术涉及一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法，属于环境检测和评价技术范畴，是通过采用‑20℃保存的鼠伤寒沙门氏菌，在复苏溶液中培养3小时，测定吸光度后直接在微孔板中进行毒物暴露3小时。选择CPRG作为酶促底物，反应30分钟后，测定吸光度。该方法对标准毒物阳性响应值可稳定至0.015mg·L

A method for rapid and high throughput detection of biogenotoxicity of compound pollutants in drinking water

The invention relates to a method for drinking water pollutants composite biological genetic toxicity of fast and high throughput detection, which belongs to the category of environmental detection and evaluation technology by Salmonella typhimurium using 20 C preservation, 3 hours of training in the recovery solution, absorbance was measured after 3 hours of direct exposure in microplates. CPRG was selected as a substrate, and the absorbance was determined after 30 minutes. The method can stabilize the positive response value of the standard poison to 0.015mg. L

【技术实现步骤摘要】
一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法
本专利技术涉及一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法，属于环境检测和评价技术范畴。
技术介绍
饮用水是人类的必需品，水质直接影响人体健康。目前世界上已经合成或已鉴定的化学物质有1300多万种，常见的或在用的有8万种之多。其中具有致癌性的物质，如多环芳烃(苯并芘、煤焦油等)、芳香胺类等多种化学污染物及亚硝胺、亚硝酰胺等消毒副产物等，在饮用水中含量极低并且以混合物状态存在。基于化学仪器的单一指标的检测具有局限性，不能直接反应对生物的遗传毒性效应。因此，饮用水中复合污染物生物毒性效应的测定在水质健康风险评估中至关重要。目前，致突变试验已被ISO和德日等国家列入标准的检测方法的有Ames试验和umu测试。Ames试验使用菌株多，试验操作繁杂，操作要求严格无菌，同时会受组氨酸干扰，出现疑似阳性结果。在对水样进行遗传毒性检测时，对水样量需求量高，造成水质管理成本加大。检测结果方面也无法定性和定量的描述。相比较之下，传统的umu测试方法所用水样量少，不需要严格灭菌条件，可用吸光度测定分析，操作简单，易定量，具有很高的应用可行性。目前，该方法已经广泛用于检测水体、土壤、大气颗粒物等样品的遗传毒性。但是传统的umu测试方法仍存在不足。传统方法的菌株-80℃超低温保存条件，很多行业无法达到这种要求，极大的限制了方法的应用和推广；传统方法需要对菌株进行复苏和前培养过程，所需接近20小时，延长了测试时间；国际标准中ISO13829中规定的对菌株细胞破壁过程采用试剂体积大，种类多，容易造成实验误差；国际标准中规定的方法中ONPG溶液作为酶促反应底物，检测结果显示细胞对毒性物质的阳性响应值低，降低了实验数据的准确性；另外，应急水质监测时，传统方法耗时耗力，无法应对大量样品的毒性高通量测试。因此，开发一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服菌株-80℃超低温保存难以广泛推广以及传统SOS/umu测试法测试周期长、实验试剂需求量大、实验误差大、难以应对大批量的样品等不足，建立一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量的测试方法，研究-20℃低温保存菌株可行性，优化实验试剂和条件，缩短毒性暴露时间，限于8小时内完成全过程检测。该专利技术是一种灵敏度高、快速、批量性、规范化检测水样的方法，能够高通量检测样品生物遗传毒性。本专利技术解决上述问题的技术方案如下：饮用水中复合污染物生物遗传毒性高通量检测的方法，包括以下步骤：取40μL贮存于-20℃条件的S.typhimuriumTA1535/pSK1002菌株于4mLTGA培养基中，于37℃培养3h，进行菌株活化。吸取98μL活化后的菌株至96微孔板中，将一系列浓度梯度的4-NQO标准溶液依次加入2μL，进行毒物暴露。微孔板须于37℃，1000rpm下进行培养3h。于波长570nm下，测定A595。培养结束后，加入4mg·mL-1CPRG溶液，进行酶促反应。反应30min后，中止反应，测定A570。通过计算β-半乳糖苷酶的活性大小(RGA)，即分别计算饮用水中毒性物质和标准毒物4-NQO的诱导比率(IR)即根据环境样品的IR值与4-NQO的IR进行比较，得出环境样品的4-NQO的等当量浓度(TEQ4-NQO)：根据成年人的体重70kg和每日饮用水量为2L计算，饮用水中复合污染物生物遗传毒性致癌风险评价方法为：注：P值大于10-6，无致癌风险；P值处于10-6～10-4之间，需对水样进行控制；P值低于10-4时，有致癌风险。本专利技术的有益效果是：利用鼠伤寒沙门菌S.typhimuriumTA1535中导入了携带umuC-LacZ融合基因的启动子及四环素和氯霉素耐药基因，实现-20℃条件下两个月内稳定保存菌株，有利于各行业推广使用。使用该菌株作为毒物的受体，优化现有的驯化、后培养细菌的方法，缩短菌株培养时间和毒性检测时间。同时通过微孔板法代替试管法，将限定实验在8小时之内，实验流程简化，测试时间缩短，灵敏度高，准确性好。同时，优化试剂使用和实验其他测试条件，节约成本，提高工作效率，能够批量进行检测水样，特别是用于饮用水、水源水、尤其是突发应急状态的水质的检测，快速准确反映水质的状态，是一套快速、准确度高、高通量的生物遗传毒性测试方法。附图说明附图1饮用水中复合污染物生物遗传毒性高通量的检测方法的技术路线示意图。附图2实施示例中本专利技术方法与传统方法诱导率随4-NQO浓度变化对比曲线图。具体实施方式为使该专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术的饮用水中复合污染物生物遗传毒性的高通量的检测方法，所依据的原理为：umu实验菌株鼠伤寒沙门菌S.typhimuriumTA1535中导入pSK1002特异性质粒，该质粒携带umu操纵子、umuD基因和umuC-LacZ融合基因的启动子及四环素和氯霉素等耐药基因。当该菌株在外界环境下产生DNA损伤，菌体RecA基因产物被激活，成为具有活性的蛋白酶，此酶可切除阻遏蛋白lexA，启动umuC操纵子，并因此引起umuC-LacZ融合基因转录、翻译，表达出β-半乳糖苷酶活性的融合蛋白，通过检测特定底物的分解情况来表征酶被诱导的活性，即可判断受试菌体引起DNA损伤的程度，即可检测暴露在某种环境中的生物遗传毒性的程度和大小。更具体的说，在特定反应阶段反应产物在特定波长570nm和595nm下吸光度值(OD)不同，通过A570/A595表征β-半乳糖苷酶的活性大小(RGA)。通过公式(1)和(2)计算饮用水中复合污染物的生物遗传毒性的等当量浓度和致癌风险大小。本专利技术的饮用水中生物遗传毒性的检测方法的具体步骤包括：配制标准毒物4-NQO的梯度系列称取5mg4-NQO固体粉末于10mLDMSO中，充分混匀，直至完全溶解，配制成500mg·L-1的溶液。吸取25μL500mg·L-14-NQO溶液于175μLDMSO中，充分混匀，配制成62.5mg·L-1的4-NQO溶液。依次取20μL62.5mg·L-14-NQO溶液于20μLDMSO溶液中，连续两倍稀释，配置成0mg·L-1、0.98mg·L-1、1.95mg·L-1、3.90mg·L-1、7.81mg·L-1、15.63mg·L-1、31.25mg·L-14-NQO标准溶液。绘制4-NQO标准曲线分别取各浓度标准溶液2μL至98μL菌液中，分别测定不同标准毒物浓度下特定波长下A570和A595值。通过计算不同处理的β-半乳糖苷酶的活性大小(RGA)，即通过计算不同浓度的毒性物质诱导率(IR)，即拟合标准曲线方程：IR＝kC4-NQO+b，得到曲线如图1所示。饮用水样的预处理及生物遗传毒性的检测饮用水样2L用玻璃纤维滤膜过滤(若水样干净，此步可略去)。HLB固相萃取柱用6mL甲醇、6mL超纯水依次活化，使液体自然留下，并保持萃取柱湿润。水样以10mL/min的流速通过活化好的固相萃取柱。待水样全部通过后，用氮气吹干或者固相萃取装置抽干萃取柱。吹干后的固相萃取柱用8mL丙酮洗脱，使其自然通过固相萃取柱。洗脱液在微弱的氮气流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法，其特征在于通过选择使用TGA溶液对菌株进行复苏后，直接在微孔板中进行毒性物质的暴露，实验中合并前培养和复苏过程，缩短实验时间，简化实验流程，降低实验成本。

【技术特征摘要】
1.一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法，其特征在于通过选择使用TGA溶液对菌株进行复苏后，直接在微孔板中进行毒性物质的暴露，实验中合并前培养和复苏过程，缩短实验时间，简化实验流程，降低实验成本。2.根据权利要求1所述的一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法，其特征在于S.typhimuriumTA1535/pSK1002菌株保存方式为-20℃菌株10倍稀释后于37℃培养15.5h后，与DMSO以9:1的比例混合均匀，分装1.5mL塑料管，于-20℃保存，上述条件下保存60天均可用于饮用水中复合污染物生物遗传毒性测定，采用-20℃保存的菌株，降低了保存难度，节约了实验开支，提高了实验灵敏度和稳定性，有利于技术的广泛推广。3.根据权利要求1所述的一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法，其特征在于复苏菌液采用TGA溶液。4.根据权利要求1所述的一种饮用水中复合污染物生物遗传毒性快速、高通量检测的方法，其所述的100μL4-NQO标准毒物溶液在微孔中的浓度分别为：0mg·L-1、0.02mg·L-1、0.039mg·L...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红岩，李罗英，于志勇，李洁，郑蓓，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11