一种用于治疗皮肤缺损的可移植性产品的制备方法技术

以来源于胎膜的生物载体膜为支架，用组织细胞工程的方法，将具有活性的功能细胞、基质细胞和组织基质成分构建成机体组织替代物，用于治疗人体组织缺损性疾病。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于一种治疗皮肤缺损的可移植性产品的制备方法，其产品为皮肤替代物，含有来源于胎膜的生物支架膜和皮肤活细胞。本专利技术要求6/16/03提交的临时申请US60/478,427的权益。
技术介绍
术语皮肤替代物(skin equivalent graft)是在特定的环境或实验室中，将表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞按一定比例种植在铺有胶原蛋白的载体膜上培养，构成一皮肤类似结构的替代物。组织培养支架(tissue culture insert)制造一个具有三维结构的支架，人为地将组织细胞种植在支架的不同层面上，使得细胞能够得到充分营养供应和形成具有三维构象的组织替代物。胎膜(extraembryonic membrane)由羊膜和绒毛膜组成。绒毛膜指的是胎膜的外层，其外表面与母体蜕膜接触。羊膜指的是胎膜的内层，包括羊膜上皮和基底层，羊膜可以轻易地从绒毛膜上剥离得到。(R.N.Matthews et al.Obstet Gynaecol Annu.1982，1131-58.)。外根鞘(ORS)细胞来源于人体毛囊外根鞘部位。ORS细胞通过扩增可不断生成表皮角质形成细胞，这样就可以避免采用手术或吸泡方式获取皮肤或粘膜角质形成细胞。而且，ORS细胞可来自患者自身并通过体外细胞培养产生患者自身的角质形成细胞(M.A.Pham et al.J Invest Dermatol.1990，94(6)749-52.；A.Limat et al.Cell Tissue Res.1994，275(1)169-76.)。表皮细胞来自于人体皮肤最外层的表皮层，至少含有两种细胞类型，大多数细胞属于角质细胞，少数细胞属于黑素细胞。真皮细胞来自于表皮下的真皮层，真皮细胞的主要类型是成纤维细胞。美国专利4,304,866公开了一种可移植的具有生物活性的角质组织膜。美国专利4,485,096公开了一种组织替代物及其制备方法。美国专利5,106,949公开了一种胶原蛋白组分及其制造方法。美国专利5,536,656公开了一种通过成层胶原蛋白胶状膜来构建皮肤替代物。美国专利6,326,019公开了一种由羊膜制成的移植物，及其分离、保存的方法，并在外科手术中得到应用。从解剖学和功能学上来讲，皮肤可分为表皮层和真皮层。表面的表皮层是抵抗感染和防止水分流失的屏障，表皮细胞多数属于角质细胞，表皮干细胞位于基底层，通过不断增殖、分化，由里向外依次形成短暂扩充细胞，即角质形成细胞，和有丝分裂期后分化细胞，以及角质化细胞(E.Christophers，J Invest Dermatol 1971，56165-169.；J.R.Bickenbach et al.Cell Tissue Kinet 1986，19325-333.)。表皮干细胞和角质形成细胞是表皮细胞增殖源。干细胞终生具有不断增殖和自我更新的能力。(L.G..Lajtha Differentiation.1979，1423-34.；F.M.Watt.Curr OpinGenet Dev 2001，11(4)410-7.；G.Cotsarelis et al.Exp Dermatol，1999，880-88.)。位于深层的真皮层使皮肤具有弹性，并保持其结构的完整，并且真皮内还有为表皮层提供营养的血管。毛囊、汗腺等附属器跨越真皮层和表皮层。皮肤感觉神经通过真皮组织进入表皮层。表皮的再生主要是位于基底层的表皮干细胞不断增殖分化的结果。在创伤恢复过程中，新生成的表皮组织从创伤的边缘开始生长，如果伤口宽度超过几厘米时创面就不能够充分愈合。这时就需要利用皮肤替代物来帮助伤口愈合。创面覆盖需要一种可以恢复表皮屏障功能的材料，并在修复过程中能与创面融合为一体的材料(R.G.Tompkins et al.Alternative Wound Coverings.In Herndon D，ed.Total Burn Care，1sted.PhiladelphiaW.B.Saunders Company Ltd，1996164_72.)。创面修复分为暂时性修复和永久性修复两类。暂时性修复可以通过同种异体移植和异种移植来实现。人羊膜和其它多种人造生物膜作为暂时性创面覆盖物(I.Jones et al.British Journal of Plastic Surgery.2002，55185-193.)已经被广泛应用于临床，用于治疗皮肤损伤。暂时性创面覆盖物用于浅表性烧伤效果最佳。虽然它可以形成抵抗感染和控制水分流失的屏障，从而为表皮再生提供有利的生长环境，但在皮肤永久性移植方面却没有什么作用。这种利用人羊膜作为暂时性创面覆盖物的方法早在1910年就已经有了记载，之后Matthews等在1982年就此作了回顾性综述。在皮肤缺损修复过程中，将表皮细胞移种到创伤区域，所移种的表皮细胞可以不断产生新细胞，可以实现永久性创面愈合。为了达到这一目的，皮肤替代物便由此而产生。目前临床所使用的皮肤替代物是在人工膜上载有来源于同种异体皮肤的表皮细胞，但同种异体细胞对皮肤损伤往往没有永久性修复的功能；同时，目前人工皮的供应有限，临床需要支付很高的治疗费用。另外，目前市场上还没有用于修复皮肤缺损和损伤的真正的皮肤替代物。人羊膜来自胎膜，由单层立方形羊膜细胞附着在富含胶原蛋白的基底膜上所形成的内羊膜和疏松地附着在绒毛膜上的外层结缔组织构成。它可以分为三层单层的上皮层、较厚的基底膜、和无血管的结缔组织层(R.N.Matthews et al.Obstet GynaecolAnnu.1982，1131-58.)。研究发现人羊膜含有III型和V型胶原蛋白。它还含有类似角膜上皮基底膜的IV型和VII型胶原蛋白，以及纤维结合蛋白和层粘蛋白。另外，它还含有成纤维细胞，在冷冻保存的羊膜中还发现了其它种类的生长因子(S.C.G.Tseng，et al.Medical and Surgical Management Ed.E.J.Holland et al.in press，2001.)。研究发现，羊膜有助于上皮的形成、正常表皮型的维持，并且可以防止感染、抑制疤痕形成、促进血管形成和组织的附着。另外，人们还认为羊膜具有非免疫原性。有关羊膜抗体或细胞介导的免疫反应未见报道，这表明羊膜具有较低的免疫原性。因而，羊膜移植中不需要使用全身性免疫抑制剂。绒毛膜的表面由滋养细胞构成。其表面和母体蜕膜融合在一起。在滋养层之下有假基底层和“结缔组织”层。本专利技术设计一种方法，来制备一种利用胎膜进行细胞培养的支架。从而可以将同种异体或自体的表皮细胞和真皮细胞移种在支架固定的胎膜上，构建与人体皮肤组织学构造相似，而且可以永久性修复皮肤缺损的皮肤替代物。
技术实现思路
本专利技术提供一种可以用作修复皮肤缺损的皮肤替代物的制备方法。本专利技术提供一种特殊支架的制作方法，支架是由母环、插环和固定在其上的胎膜三部分构成，主要用于皮肤替代物的构建。本专利技术提供一种载有同种异体皮肤细胞与胎膜构建异体皮肤替代物的制备方法。本专利技术提供一种利用载有自体同源表皮细胞或毛囊细胞与胎膜构建自体皮肤替代物的制备方法。本专利技术提供一种根据人体皮肤组织学结构构建皮肤替代物的制备方法。本专利技术提供一种制备胎膜并将其用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可移植的组织替代物的制备方法，此组织替代物可用于人体组织缺损的修复，包括：ａ）制备一种用于构建载有活细胞的皮肤替代物的组织培养支架，支架可以自由装配，所述支架包括以下部分：ｉ）母环：为一圆筒状结构，底壁四周有孔洞，当将支 架放入培养容器中时，培养液可自由通过孔洞进出支架腔；ｉｉ）插环：为一圆环状结构，可插入母环内。用插环将一生物载体膜固定在上述母环内，从而生物载体膜和插环环壁形成上培养室；和ｉｉｉ）生物载体膜来源于胎膜，将母环分隔成上下两个独 立的培养空间；ｂ）种子细胞的制备，包括功能细胞和基质细胞的制备；ｃ）将上述种子细胞通过支架内不同的培养腔室移种到制备好的生物载体膜上进行细胞培养，和组织替代物的构建；ｄ）从支架上将构建好的组织替代物取下，用于组织缺损 的修复。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：王正品，
申请(专利权)人：华北制药集团新药研究开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]