用于治疗和预防Ⅰ型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途制造技术

一种重组ＤＮＡ分子，其编码谷氨酸脱羧酶Ｔ细胞相关表位肽或者编码一种谷氨酸脱羧酶Ｔ细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于治疗和预防I型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途。更具体地，本专利技术的重组腺相关病毒中包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子含有编码谷氨酸脱羧酶肽(GAD肽)、或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽(GADt肽)、或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白(GADt-IgG)、或编码谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白(GAD-IgG)的核酸序列。本专利技术还涉及包含所述重组DNA分子或融合蛋白的药物组合物。
技术介绍
机体发育和生命维持过程中，免疫系统的自我识别功能是对自身组织器官保护的重要因素。当自身耐受遭受攻击时，免疫系统对自身抗原产生免疫应答，机体产生自身抗体并出现自身反应性T细胞等免疫系统改变时可导致自身免疫。当自身免疫发展到一定程度，对自身组织器官产生破坏并引起临床症状时便可引起自身免疫病。在抗移植排斥、I型超敏反应中，也存在着类似的免疫系统紊乱。如何诱导机体产生对自身或目的抗原的耐受是临床有效治疗的关键，也是免疫学研究所亟待解决的问题。自身免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、重症肌无力、葡萄膜炎、强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、多发性硬化症、全身性红癍狼疮等是一类严重危害人类健康的疾病。大量研究结果证实免疫细胞功能异常是这类疾病发生的主要原因，临床对这类疾病的治疗主要是药物性对症处理，如用于IDDM治疗的胰岛素和甲氨蝶呤、环孢霉素-A、激素等免疫抑制类药物；如果能诱导机体对致病原产生特异性免疫耐受，将可能为这类自身免疫性疾病的治疗提供有效的手段。I型糖尿病(IDDM)是机体免疫系统中T淋巴细胞对自身胰岛β细胞的识别障碍，导致胰岛组织破坏的一类自身免疫性疾病。如何纠正T淋巴细胞对自身抗原的识别障碍并诱导机体产生免疫耐受，阻断这类细胞对胰岛组织破坏，是对IDDM治疗成功所亟待解决的问题。诱导耐受的免疫原通常是抗原，它受抗原的理化性质、剂量、进入途径及机体遗传背景等的影响。许多抗原分子上存在着与T细胞相关的表位肽——抗原肽，它们通过抗原呈递细胞(APC)将抗原肽/MHC复合物呈递给T细胞，诱导免疫耐受效应。协同刺激信号的缺失、CTLA-4上调及Th1/Th2平衡改变等均参与特异性耐受的诱导，但作用机制尚不十分清楚。I型糖尿病患者的血清中可以检出多种针对胰岛β细胞及其成分的自身抗体，如胰岛β细胞抗体(ICA)、胰岛素抗体(IAA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)、酪氨酸磷酸酶(IA-2A)、热休克蛋白抗体。国外I型糖尿病中GAD抗体阳性率为60.9-78.8％，国外II型糖尿病中GAD抗体阳性率为5.0-38.2％，国内II型糖尿病中GAD抗体阳性率为14.8-38.2％。1990年Baekkeskov等证明自身胰岛β细胞抗原GAD是IDDM的关键始动靶抗原。对人类I型糖尿病研究的理想动物模型NOD小鼠研究发现在第5周其对GAD耐受缺失。如何纠正T淋巴细胞对自身抗原GAD的识别障碍并诱导机体产生特异性针对GAD免疫耐受，进而阻断这类细胞对胰岛组织破坏，是对IDDM治疗成功所亟待解决的问题。耐受载体IgG可为具有T细胞表位的抗原肽提供运载系统研究已有30多年历史，T.Scott等把λcI免疫显性表位序列p12-26的基因构建在IgG的重链N端，经B细胞呈递诱导出特异性免疫耐受，这提供抗原肽抗体诱导特异性免疫耐受的可行性。Rajeev等构建了葡萄膜炎相关抗原肽IRBP/IgG抗原肽抗体，利用逆转录病毒途径对葡萄膜炎小鼠进行基因治疗，证实抗原肽抗体诱导特异性耐受的可行性。免疫球蛋白作为抗原肽融合蛋白骨架的研究结果提示它在诱导免疫耐受中具有以下优点(1)可以系统用药，(2)进入体内后可迅速分布于全身，(3)半寿期较长，可与各类抗原呈递细胞充分接触。(4)通过APC细胞上FcRII介导的负调控信号转导途径诱导免疫耐受的产生。随后，Moustapha El-Aminem等采用把耐受原基因GAD片段移植在免疫球蛋白N端的融合子——GAD抗原肽抗体通过逆转录病毒对NOD小鼠进行基因治疗，GAD抗原肽抗体通过逆转录病毒感染脾脏B细胞后尾静脉回输NOD小鼠体内进行基因治疗，可诱导NOD小鼠产生特异性免疫耐受反应。Moustapha El-Aminem等认为B细胞抗原呈递是耐受诱导所必需的，研究认为获得特异性耐受的APC是静止的B细胞，而静止的B细胞的是缺少共刺激信号，因而，抗原肽抗体被B细胞提呈给Th细胞时，由于缺少B细胞共刺激信号的，导致特异性Th细胞的耐受。载体的选择直接影响到基因治疗的安全性，所选的载体需要具备安全性好、对人体不致病、宿主范围广、理化性质优越、便于实验操作等特性。本专利技术选用的载体AAV为有以下特点安全性好，迄今尚未见到野生型AAV对人体致病的报道，去除96％的野生型AAV基因组的重组AAV，可进一步保证使用安全性；宿主范围广，对处于分裂期和静止期细胞均有较好的转染效率；野生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置；AAV-2基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作；物理性质稳定，在60℃下短时间内不能被灭活、能抗氯仿；重组AAV可长期稳定地表达外源基因。本专利技术通过腺相关病毒载体(AAV)介导GAD、GAD-IgG、GADt或GADt-IgG，诱导机体淋巴细胞对自身GAD产生免疫耐受，达到对糖尿病进行有效治疗的目的。并且，它将为细胞免疫紊乱所致自身免疫性疾病的治疗提供新的手段，并有着广泛的临床应用前景。目前国外应用致病抗原肽抗体的基因疗法治疗自身免疫性疾病正处于实验室研究阶段，我国尚未见到有关研究报导；而用GAD-IgG进行糖尿病的基因治疗在国内外尚未见到应用研究报导和专利。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的重组腺相关病毒及其用途。更具体地，本专利技术的重组腺相关病毒包含一种重组DNA分子，该重组DNA分子含有编码谷氨酸脱羧酶肽(SEQ ID NO.2)或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽或编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白或编码谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白的核酸序列。本专利技术的另一个方面是提供一种重组DNA分子，它含有编码谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽的基因(碱基序列见SEQ ID NO.2，氨基酸序列见碱基序列见SEQ ID NO.7)或者编码一种谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白的基因(碱基序列见SEQ IDNO.1，氨基酸序列见碱基序列见SEQ ID NO.8)，该融合蛋白和谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽都能够诱导机体产生免疫耐受。本专利技术的又一个方面是提供一种包含本专利技术的重组DNA分子的重组病毒载体，该重组病毒载体中所包含的重组DNA分子核酸序列编码了能够诱导机体产生免疫耐受的谷氨酸脱羧酶肽或谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽或谷氨酸脱羧酶T细胞相关表位肽和免疫球蛋白的融合蛋白或谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白的融合蛋白，该重组病毒载体用于将所述重组DNA分子导入机体细胞。适合的病毒载体包括腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、新培斯病毒或鸡痘病毒。本专利技术的另一方面是提供一种用于治疗和预防I型糖尿病的新的药物组合物。该药物组合物包含一种融合蛋白质，该蛋白质由谷氨酸脱羧酶肽和免疫球蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黎燕，沈倍奋，王建安，王仁喜，韩根成，宋伦，钱家华，吴小兵，董小岩，曹晖，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，本元正阳基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：