离体快速繁殖地乌的方法技术

本发明专利技术属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种离体快速繁殖地乌的方法。该方法包括地乌外植体的选择与消毒，不定芽的诱导与增殖，拟球茎诱导与增殖、胚性愈伤组织的诱导、增殖、分化及生根等完整步骤。本发明专利技术提出了地乌外植体无菌消毒培养体系、培养程序及专用培养基等多项关键技术，成功地培育出地乌试管苗。本发明专利技术克服了自然条件下地乌繁殖周期长、繁殖系数低等缺点，为工厂化快速繁殖地乌试管苗提供了实用技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种。
技术介绍
地乌，其学名是林荫银莲花(Anemone Flaccida Fr. Schmidt)为多年生草本，属于毛茛科银莲花属植 物，其干燥根茎称为地乌，俗称地乌。每年3 5月为地乌地上部生长发育时期。基生叶1一2片，长叶柄， 五角形，长2 7cm，宽3 10cm。根状茎近圆柱形，最大直径为lcm, 3 5年方能采收入药。地乌野生 资源主耍分布丁长江中下游各省海拔1500 3000m的山坡林下阴湿处，鄂西山地分布相对集中。由此看来， 野生地乌分布面积有限，生长期短，生长缓慢，生物量小，属于珍稀植物。地乌性味温、辛、微苦，由地乌提取物制成的银莲花胶囊具有祛风湿、强筋骨、消肿止痛之功效，地 乌对类风湿性关节炎有良好的治疗作用.而且毒副作用很小。由于野生地乌珍稀，对地乌进行中成药开发； 不能仅仅依靠野生资源，必须规模化人工栽培，否则，将导致地乌野生资源枯竭，自然生态环境遭到破坏。通过检验，地乌种子活力很低，目前，在实验室条件下很难用其种子直接发芽生产地乌种苗。因此， 现阶段地乌规模化人工栽培的种苗只嫩那个通过地乌的离体繁殖(组织培养)来获取，关于地乌的离体快 速繁殖目前国内外文献中尚未见报导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种，以縮短常规育苗时间， 提高育苗效率，实现地乌的快速繁殖。 本专利技术通过以下技术方案实现 一种离体繁殖地乌的方法，包括以下步骤 (1)外植体的选择与消毒1) 选择地乌根茎带老组织的长度为l-2cm的休眠芽和刚萌发未展开的叶片作外植体；2) 将该外植体用如下方法进行消毒a. 外植体为休眠芽的消毒先在自来水下将地乌根茎芽体表面的泥沙冲洗干净，并用软毛刷将乌根茎 芽体表面的老死组织刷洗干净，至芽体呈现白色，用1.5。/。的多菌灵水溶液浸泡2h，在用自来水冲洗0.5h, 转移至超净工作台，用75%酒精消毒30-60 s,无菌水冲洗l-2遍，再用0.2%升汞溶液消毒8-12 min，无菌 水冲洗4-5遍，使该外植体在每次无菌水中的冲洗时间至少保持为min，备用；b. 外植体为刚萌发未展开的叶片的消毒将刚萌发未展开的叶片用自来水冲洗干净，转移至超净T.作 台上，用75。/。酒精消毒30s， 0.2%升汞消毒5 min，无菌水冲洗2-3遍，备用；(2)接种与培养用无菌滤纸吸去所述外植体表面水分，将所述叶片切成lcmXlcm小块；或将休 眠芽表面的老组织切除，然后从该芽中间剖开；将所述的休眠芽或叶片的外植体接种到不定芽或拟球茎诱 诱导培养基上，诱导产生不定芽或拟球茎；或者将所述的芽或刚萌发未展开的叶片外植体接种到胚性愈伤 组织诱导培养基上，使其诱导产生胚性愈伤组织；外植体培养条件为每天光照12h,培养温度17-20。C; 光照强度3000Lux,得到地乌不定芽或拟球茎或胚性愈伤组织；(3) 继代、增殖与分化培养将步骤(2)得到的拟球茎或不定芽转移到不定芽或拟球茎增殖培养基 上进行增殖培养；或将步骤(2)得到的胚性愈伤组织转移到胚性愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养，进而再转移到分化培养基上培养，得到丛生芽；继代、增殖和分化的条件每天光照12h，培养温度17-20 'C,光照强度为3000Lux;(4) 生根培养将步骤(3)的拟球茎或不定芽或丛生芽转移到生根培养基上培养40-50d，使其生根； 培养条件为5'C,暗培养；所述培养基成分如下不定芽或拟球茎诱导培养基MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;胚性愈伤组织诱导培养基MS基本培养基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0;不定芽或拟球茎增殖培养基MS基本培养基+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;胚性愈伤组织增殖培养基MS基本培养基+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8°/^1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0;分化培养基MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂， 3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;生根培养基1/2MS基本培养基+0.2mg/LNAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8°/<^1°/。琼脂，3%蔗糖，补 充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0。为了叙述方便，在本说明书的后面部分，申请人将"休眠芽"，称之为"芽或地乌芽"，将"刚萌发未 展开的叶片"称之为"叶片或地乌叶片"，其含义同上述的定义是一个意思。本专利技术的效果是(1) 本专利技术采用的外植体来源不受季节限制，可以周年进行地乌的组织培养；(2) 离体培养下的地乌体细胞胚可通过次生胚不断增殖；具有良好的增殖效果；(3) 本专利技术的方法对提高不定芽、拟球茎诱导率和体细胞胚分化率显著。 更详细的技术方案见《具体实施方式》。附图说明图la和图lb:是以地乌刚萌发未展开的叶片为外植体诱导产生的丛生芽。 图2a和图2b:是以地乌休眠芽为外植体诱导产生的丛生芽。 图3a和图3b:是以地乌刚萌发未展开的叶片为外植体诱导产生的拟球茎。 图4a和图4b:是以地乌休眠芽为外植体诱导产生的拟球茎。 图5:是以地乌休眠芽为外植体，经过体细胞胚发生途径的不同阶段外植体形态具体实施例方式实施例1 (通用培养程序) 一种，其步骤如下(1) 外植体的选择与消毒1) 选择地乌根茎带老组织的长度为l-2cm的休眠芽和刚萌发未展开的叶片作外植体；2) 将该外植体用如下方法进行消毒a. 外植体为休眠芽的消毒先在自来水下将地乌根茎芽体表面的泥沙冲洗干净，并用软毛刷将乌根茎 芽体表面的老死组织刷洗干净，至芽体呈现白色，用1.5。/。的多菌灵水溶液浸泡2h，在用自来水冲洗.Q.5h， 转移至超净工作台，用75%酒精消毒30-60 s，无菌水冲洗l-2遍，再用0.2%升汞溶液消毒8-12111111，无菌 水冲洗4-5遍，使该外植体在每次无菌水中的冲洗时间至少保持为lmin，备用；b. 外植体为刚萌发未展开的叶片的消毒将刚萌发未展开的叶片用自来水冲洗干净，转移至超净工作 台上，用75°/。酒精消毒30s， 0.2。/。升汞消毒5min，无菌水冲洗2-3遍，备用；(2) 接种与培养用无菌滤纸吸去所述外植体表面水分，将所述叶片切成lcmXlcm小块；或将休 眠芽表面的老组织切除，然后从该芽中间剖开；将所述的休眠芽或叶片的外植体接种到不定芽或拟球茎诱 诱导培养基上，诱导产生不定芽或拟球茎；或者将所述的芽或刚萌发未展开的叶片外植体接种到胚性愈伤 组织诱导培养基上，使其诱导产生胚性愈伤组织；外植体培养条件为每天光照12h，培养温度17-2(TC， 光照强度3000Lux，得到地乌不定芽或拟球茎或胚性愈伤组织；(3) 继代、增殖与分化培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种离体快速繁殖地乌的方法，其特征在于以下步骤：　（１）外植体的选择与消毒：　１）选择地乌根茎带老组织的长度为１－２ｃｍ的休眠芽和刚萌发未展开的叶片作外植体；　２）将该外植体用如下方法进行消毒：　ａ．外植体为休眠芽的消毒：先在自来水下将地乌根茎芽体表面的泥沙冲洗干净，并用软毛刷将乌根茎芽体表面的老死组织刷洗干净，至芽体呈现白色，用１．５％的多菌灵水溶液浸泡２ｈ，在用自来水冲洗０．５ｈ，转移至超净工作台，用７５％酒精消毒３０－６０ｓ，无菌水冲洗１－２遍，再用０．２％升汞溶液消毒８－１２ｍｉｎ，无菌水冲洗４－５遍，使该外植体在每次无菌水中的冲洗时间至少保持为１ｍｉｎ，备用；　ｂ．外植体为刚萌发未展开的叶片的消毒：将刚萌发未展开的叶片用自来水冲洗干净，转移至超净工作台上，用７５％酒精消毒３０ｓ，０．２％升汞消毒５ｍｉｎ，无菌水冲洗２－３遍，备用；　（２）接种与培养：用无菌滤纸吸去所述外植体表面水分，将所述叶片切成１ｃｍ×１ｃｍ小块；或将休眠芽表面的老组织切除，然后从该芽中间剖开；将所述的休眠芽或叶片的外植体接种到不定芽或拟球茎诱诱导培养基上，诱导产生不定芽或拟球茎；或者将所述的芽或刚萌发未展开的叶片外植体接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，使其诱导产生胚性愈伤组织；外植体培养条件为：每天光照１２ｈ，培养温度１７－２０℃，光照强度３０００Ｌｕｘ，得到地乌不定芽或拟球茎或胚性愈伤组织；　（３）继代、增殖与分化培养：将步骤（２）得到的拟球茎或不定芽转移到不定芽或拟球茎增殖培养基上进行增殖培养；或将步骤（２）得到的胚性愈伤组织转移到胚性愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养，进而再转移到分化培养基上培养，得到丛生芽；继代、增殖和分化的条件：每天光照１２ｈ，培养温度１７－２０℃，光照强度为３０００Ｌｕｘ；　（４）生根培养：将步骤（３）的拟球茎或不定芽或丛生芽转移到生根培养基上培养４０－５０ｄ，使其生根；培养条件为：５℃，暗培养；　所述培养基成分如下：　不定芽或拟球茎诱导培养基：ＭＳ基本培养基＋２．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋０．２ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ，头孢噻肟钠３００ｍｇ／Ｌ，０．８％～１％琼脂，３％蔗糖，补充蒸馏水至１Ｌ，调ｐＨ至５．８－６．０；　胚性愈伤组织诱导培养基：ＭＳ基本培养基＋２．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ＋１．０ｍｇ／Ｌ　ＮＡＡ，头孢噻肟钠３００ｍｇ／Ｌ，０．８％～１％琼脂，３％蔗糖，补充蒸馏水至１Ｌ，调ｐＨ至５．８－６．０；　不定芽或拟...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱端卫，张忠池，杨特武，耿明建，黄漫翔，方贤东，李宏飞，王俊，辛龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]