免疫势差制造技术

本发明专利技术提供一类载体分子，当它们连接到免疫原上时能提高宿主的免疫应答，不管这种免疫原和载体的复合物是通过肠胃外，还是肠内或口服途径施用于宿主都有此效果．本发明专利技术还提供了复合物的生产方法、编码本发明专利技术复合物的ＤＮＡ杂交序列、含有所述ＤＮＡ杂交序列的ＤＮＡ重组分子、转化细胞和包括本发明专利技术复合物的疫苗及生产所述疫苗的方法．（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类连接到免疫原上能增强宿主对该免疫原应答的分子，无论复合物是肠胃外施用、肠内施用或口服都有此效应。ATCC 67331是一株大肠杆菌，于1987年3月2日寄存在美国标准菌种收集中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852，USA)。为了保护动物抵抗病原体(细菌、病毒或寄生物)的侵入，通常是给动物接种完整生物体或病原体亚基疫苗以在宿主体内诱发保护性免疫应答。由于抗原侵入产生的免疫应答往往可通过共同施用免疫势差剂或佐剂而增强。其中最好的是贮存型的佐剂(如完全弗罗因德氏(Freund)佐剂、不完全弗罗因德氏佐剂或Montanide)。这些佐剂能增强抗体应答，可将单独注射抗原达到的水平提高50到100倍。虽然完全弗罗因德氏佐剂、不完全弗罗因德氏佐剂或Montanide能大大增强抗原的免疫应答，但它们还是存在一些缺点。当以注射方式使用抗原时，注射部位通常受到很大的损伤，这对于用于人体、爱畜或食用动物是不能令人满意的。而且，这些佐剂通过口服或肠内施用不能起到免疫势差剂的作用。本专利技术涉及一类用化学方法或遗传学方法连接到免疫原或半抗原上能增强宿主对免疫原或半抗原免疫应答的分子，无论复合物是肠胃外施用、肠内施用或口服都有此效应。而且使用它们不会在注射部位产生很大的损伤。有上述能力的分子可定义为具有膜蛋白普通性能的分子，这里所举的例子来自特殊类型的膜蛋白，更准确地说是来自革兰氏阴性细菌的外膜蛋白。具体例子包括TraT蛋白质，它是一种能抵抗菌株被血清杀死的某些大肠杆菌菌株的外膜蛋白。该类的其它蛋白质还有大肠杆菌外膜蛋白OmpA和OmpF。当一定量的TraT、OmpA或OmpF(以后称为载体)不用佐剂通过肌肉注射到小鼠体内时，所诱发的抗体反应可与用可溶蛋白如BSA、鞭毛或羊IgG与不完全弗罗因德氏佐剂混合注射所诱发的抗体反应相比。实际上，由外膜蛋白诱发的抗体反应非常高，即使加上不完全的弗罗因德氏佐剂的辅助也只有少许增加。还发现，口服TraT或OmpA能显著刺激血清抗体抗TraT(1/4096)或抗OmpA(1/892)的滴度。同样发现，适量供给(109-1010)外膜中含有TraT的沙门氏菌(Salmonella)或大肠杆菌(E.coli)也可以加强抗TraT抗体的产生。将半抗原(二硝基酚，DNP)、肽(CSP)或蛋白质(牛血清清蛋白，BSA)共价偶联到OmpA或TraT上，也能起到增强对DNP、CSP或BSA的免疫应答。在第一个具体方案中，本专利技术提供了一种含有一个与载体分子偶联的免疫原的复合物，当把复合物施用给宿主时，无论是肠胃外施用、肠内施用还是口服，载体分子都能增强所述宿主对免疫原的免疫应答，其中所说的免疫原可以是抗原或半抗原，所说的载体分子包括原核或真核生物的膜结合蛋白质。在较好的方案中，载体分子是革兰氏阴性菌的外膜蛋白。较好的革兰氏阴性菌是大肠杆菌或沙门氏菌。更可取的载体分子是大肠杆菌菌株产生的TraT蛋白或外膜蛋白质OmpA或OmpF。本专利技术优先选用的免疫原包括CSP、来自轮转病毒的病毒衣壳蛋白VP7和全部或部分的真核生物蛋白质minactivin。免疫原-载体复合物可以通过化学方法形成，其中包括结合作用，例如使用合适的结合剂或连接剂;以及载体和/或免疫原上功能团的修饰和/或反应。因此，本专利技术提供了一种生产复合物的方法，该复合物含有一个偶联到载体分子上的免疫原，所说的载体分子来自原核或真核生物的膜结合蛋白质(imp)，所说的免疫原包括抗原或半抗原，当把复合物施用给宿主时，无论是肠胃外施用、肠内施用或口服，其中的载体分子能增强宿主对免疫原的免疫应答，这个方法包括下述一个或几个步骤a)使免疫原与载体反应形成上述复合物;b)化学修饰免疫原以提供至少一个能形成化学连接的功能基团，并使修饰后的免疫原和载体反应以形成上述复合物;c)化学修饰载体以提供至少一个能形成化学连接的功能基团，并使免疫原和修饰后的载体反应以形成上述复合物;d)化学修饰免疫原和载体以提供能形成化学连接的功能基团，并使修饰后的免疫原和修饰后的载体反应以形成上述复合物;e)使免疫原与至少一种连接剂反应，并使连接后的免疫原与载体分子反应以形成上述复合物;f)使载体与至少一种连接剂反应，并使免疫原和连接后的载体反应以形成上述复合物;g)使免疫原和载体与至少一种连接剂反应，并使连接后的免疫原和连接后的载体反应以形成上述复合物。本专利技术的最佳方法包括(Ⅰ)化学修饰免疫原以提供至少一个能形成化学连接的功能基团;以及(Ⅱ)使修饰后的免疫原和载体反应以形成上述复合物。连接剂可以含有一个二硫键，或可用酸、碱或高碘酸盐使之断裂。连接剂的例子包括N-(4-迭氮苯硫)苯邻二甲酰亚胺、4，4′-二硫双苯基迭氮化物、二硫双-(琥珀酰亚胺基丙酸盐)、二甲基-3，3′-二硫双丙酰亚胺盐·2HCl、3，3′-二硫双-(硫代琥珀酰亚胺基丙酸盐)、乙基-4-迭氮苯基-1，4-二硫丁酰亚胺盐·HCl、N-琥珀酰亚胺基-(4-迭氮苯基)-1，3′-二硫代丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-2-(间-迭氮基-邻-硝基苯甲酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-2-(对-迭氮水杨酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸盐、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-(4-迭氮苯二硫)-丙酸盐和2-亚氨基硫醇烷。最佳的交联剂是二琥珀酰亚胺基酒石酸盐和双-〔2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)-乙基〕-砜。载体和免疫原的连接可以通过将载体偶联到免疫原的合适基团上而达到。免疫原-载体复合物是通过化学结合形成时，例如用适当的结合剂或连接剂，最佳的结合剂和连接剂包括1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳化二亚胺、戊二醛、间-马来酰亚胺苯甲酸正-羟基丁二酰亚胺酯或N，N1-二环己基碳化二亚胺。免疫原和载体分子的连接也可通过制备杂交蛋白质分子完成，例如利用DNA重组技术产生，将编码免疫原的DNA插入或加入到编码载体的DNA序列中。因此，本专利技术提供了一种制备上述载体分子与免疫原的复合物的方法，该方法包括制备杂交蛋白质分子。在最佳的方法中，杂交蛋白质分子是通过重组技术产生，将编码免疫原的DNA插入或加入到编码载体的DNA序列中。本专利技术还提供了一个DNA杂交序列，该序列含有一个第一DNA序列，此序列至少编码部分原核或真核生物的膜结合蛋白质，并与编码免疫原氨基酸序列的DNA序列相融合;或一个与上述第一DNA序列杂交的第二DNA序列，它可从任何来源获得，包括天然的、合成的和半合成的来源;一个由于突变相关的DNA序列，包括单个或多个碱基置换、缺失、插入和上述第一DNA序列的倒位;或一个含有这样的密码子序列的DNA序列，该密码子序列表达的多肽与前面任意一种DNA杂交序列和插段的表达多肽具有相似的免疫学或生物学活性。本专利技术最佳的DNA杂交序列至少编码部分的TraT、OmpF或OmpA，此序列与编码免疫原氨基酸序列的DNA序列相连接，所得到的TraT、(OmpF或OmpA)杂交蛋白可输送到宿主细胞并与其表面发生作用。本专利技术还提供了一个融合基因，它包括一个与转移启动子融合的本专利技术的DNA杂交序列。本专利技术最佳的启动子是λ噬菌体的P1启动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合物，其特征在于它包括一个偶联到载体分子上的免疫原，当复合物施用于宿主时，载体分子能加强所述宿主对免疫原的免疫应答，不管这种复合物是肠胃外、肠内还是口服施用都有此效果，其中所说的免疫原包括抗原或半抗原，所说的载体分子包括来自原核或真核生物的膜结合蛋白。

【技术特征摘要】
AU 1986-4-21 PH5559;AU 1987-3-13 PI08461.一种复合物，其特征在于它包括一个偶联到载体分子上的免疫原，当复合物施用于宿主时，载体分子能加强所述宿主对免疫原的免疫应答，不管这种复合物是肠胃外、肠内还是口服施用都有此效果，其中所说的免疫原包括抗原或半抗原，所说的载体分子包括来自原核或真核生物的膜结合蛋白。2.根据权利要求1的复合物，其中所说的载体分子是一种革兰氏阴性菌的外膜蛋白。3.根据权利要求2的复合物，其中所说的载体分子是大肠杆菌或沙门氏菌的膜蛋白。4.根据权利要求3的复合物，其中所说的膜蛋白是由大肠杆菌产生的TraT蛋白、或外膜蛋白OmpA、或外膜蛋白OmpF。5.根据权利要求4的复合物，其中所说的膜蛋白是TraT蛋白。6.根据权利要求1-5中任何一个的复合物，其中所说的免疫原是CSP，它是来自轮转病毒的病毒衣壳蛋白VP7，或全部或部分的minactivin。7.根据权利要求1-6中任何一个的复合物，其中载体与免疫原的偶联是通过化学方法进行的。8.根据权利要求7的复合物，其中所说的偶联是通过化学结合进行的，利用一种结合剂或连接剂。9.根据权利要求8的复合物，其中所说的结合或连接剂是1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳化二亚胺、戊二醛、m-马来酰亚胺苯甲酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、或N，N1-二环己基碳化二亚胺。10.根据权利要求8的复合物，其中所说的连接剂含有一个二硫键或可通过酸、碱或高碘酸盐使之断裂。11.根据权利要求10的复合物，其中所说的连接剂选择于N-(4-迭氮苯硫)苯邻二甲酰亚胺、4，4′-二硫双苯基迭氮化物、二硫双-(琥珀酰亚胺基丙酸盐)、二甲基-3，3′-二硫双丙酰亚胺盐·2HCl、3，3′-二硫双-(硫代琥珀酰亚胺基丙酸盐)、乙基-4-迭氮苯基-1，4-二硫丁酰亚胺盐·HCl、N-琥珀酰亚胺基-(4-偶氮苯基)1，3′-二硫代-丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-2-(m-重氮-O-硝基苯甲酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-2-(P-重氮水杨酰胺基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸盐、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐、硫代琥珀酰亚胺基-(4-重氮苯基二硫)丙酸盐、2-亚胺基硫醇烷-二琥珀酰亚胺基酒石酸盐和双-〔2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)-乙基〕-砜。12.根据权利要求11的复合物，其中的连接剂是2-亚胺基硫醇烷二琥珀酰亚胺基酒石酸盐或双-〔2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧)-乙基〕砜。13.一种制备权利要求1至12中任何一个的复合物的方法，其特征在于该方法包括通过化学方法将载体分子偶联到免疫原上。14.根据权利要求13的方法，其中包括下列一个或多个步骤a).使免疫原与载体反应形成所说的复合物;b).化学修饰免疫原以提供至少一个能形成化学键的功能团，并使修饰后的免疫原和载体反应以形成所说的复合物。c).化学修饰载体以提供至少一个能形成化学键的功能团，并使免疫原和修饰后的载体反应以形成所说的复合物。d).化学修饰免疫原和载体以提供能形成化学键的功能团，并使修饰后的免疫原和修饰后的载体反应以形成所说的复合物。e).使免疫原和至少一种连接剂反应，并使连接后的免疫原和载体分子反应以形成所说的复合物。f).使载体与至少一种连接剂反应，并使免疫原和连接后的载体反应以形成所说的复合物;g).使免疫原和载体与至少一种连接剂反应，并使连接后的免疫原和连接后的载体反应以形成所说的复合物。15.根据权利要求14的方法，该方法包括(Ⅰ)化学修饰免疫原以提供至少一个能形成化学键的功能团;和(Ⅱ)使修饰后的免疫原和载体反应以形成所说的复合物。16.根据权利要求1-6中任何一个的复合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯迈克尔巴恩斯，菲利普拉尔夫莱尔巴奇，格雷戈里约翰拉塞尔琼斯，
申请(专利权)人：生物企业公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]