棉株及其株系的遗传工程制造技术

本发明专利技术揭示了一种可达到棉株及其株系遗传转化的方法。由土壤杆菌作为引起遗传转化的媒介物，未成熟的棉组织在体外进行遗传转化。所产生的棉组织须经一种或一种以上选择剂来筛选转化体。然后转化的培养物被诱发，开始体细胞胚的产生。本发明专利技术同时也揭示了一种可能使这类体细胞胚再生成为完整棉株的方法。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物遗传工程的一般技术，特别涉及一种用植物遗传转化的土壤杆菌法来转化和再生棉(Gossypium hirsutum L.)株，以产生新颖的遗传转化的棉株及其株系的对策。从事于植物生物工艺领域的许多科学家们的总目标是使用遗传方法来成功地设计各种品种优良的作物。虽然植物遗传工程已在一些典型物种中成功地进行了验证，但诸如烟草、胡萝卜和矮牵牛之类的典型物种往往并不是经济上最重要的农用植物物种。因此，人们针对农业上较为重要的植物物种的遗传工程工作了大量努力。本文所用的“遗传工程”术语系指将外来基因，通常为嵌合基因，引入一个或一个以上的植物细胞中，而这些植物细胞能被再生成为性成熟的，且能发芽的整株植物。这种植物可自花传粉，或用同样物种的其他植物进行异花传粉。由此，在种系中携带的外来基因能被嵌入或培育成农业上实用的植物品种。植物组织培养技术作为一个十分活跃的研究领域已有多年了，但在过去的5至10年中，大量的科学工作系致力于研究诸如玉米、小麦、稻、大豆和棉花之类重要农业作物的可再生的植物组织培养方法。有关棉花组织培养的早期出版物主要涉及在体外无菌条件下产生取自植物的生长组织[Davis，D.G.et al.In Vitro 9395-398(1974);Rani，A.and S.S.Bhojwani，Plant Sci.Lett.7163-169(1976);and Price，H.J.et al.，Plant Sci.Lett.10;115-119(1977)]。然而，在这些出版物中详述的方法并不提供使细胞再生成为整株植物所需的必要的骨架。本世纪七十年代后期，报道了体细胞胚，亦即从取自野生棉花物种G.Klotzchianum的非配子组织或体细胞组织中得到的胚的研究进展情况[Price，H.J.and R.H.Smith，Planta 145305-307(1979)]。令人遗憾的是，采用这一报道的方法，存在两个难以克服的重大问题。首先，即使再经几年研究，这些研究者仍然不能诱发体细胞发芽，也就是说不能使之转化，而产生整株植物(Finer，J.J.and R.H.Smith，Plant Cell Rep.341-43，1984)。其次，同样的技术不能用栽培的棉花作为植物组织的来源而成功地得以重复。戴维多涅斯(Davidonis)和汉密尔顿(Hamilton)首先发表了从棉花体细胞胚成功地再生成整株植物的报道[Davidonis，G.H.and R.H.Hamilton，Plant Sci.Lett.3289-93(1984)]。这些实验者使用Coker 310栽培品种的未成熟子叶组织。所用的基本培养基由Linsmaier和Skoog(LS)盐、维生素、植物激素NAA和激动素组成[E.M.and F.Skoog，Physiol.Plant.18100-127(1965)]。若干年来，上述报道中所用的组织一直被用于培养，但并未发现类似结果的报道，而且重复这一过程所必需的确切方法仍然未广泛地为人们所知。同一年，雷根等[Rangan，T.S.et al.，In Vitro 20256(1984)]报道了一些不同的加利福尼亚棉花栽培品种的植物再生，其原始实验记录充分表明，在适当的时期内，作者可使之重复出现。在它们的方法中，诸如子叶、未成熟的胚和胚轴组织之类的几种组织在添加了植物激素NAA和激动素的Murashige和Skoog(MS)培养基[Murashige，T.and F.Skoog，Physiol.Plant.15473-497，1962]中进行培养。经3至4个月的培养后，这些组织产生了胚发生愈伤组织和体细胞胚。然后将胚移入加有水解酪蛋白的Beasley和Ting(BT)培养基(Beasley，C.A.and I.P.Ting，Amer.J.Bot.60130-139，1973)之类的低盐培养基中，以使它们之中的一些发芽，并生长成为整株植物。使用Acala S J-5栽培品种重新获得约200株植物。植物中的一些不育性已被观察到，仅有2%植物显现出体细胞无性变异。使用Coker株系312和称为T25的Texas原种时已观察到体细胞胚发生[Robacker，D.C.and T.W.Zimmerma，In the Ann.Mtg.of the American Society of Agronomy，November 25-30，Las Vegas，NV.P.85(1984)]所用的基本培养基由MS盐、环己六醇和硫胺素类维生素、蔗糖、植物激素NAA，2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和激动素配制而成。胚轴被用作原始组织来源。尽管胚被复原，并在BT培养基中进行培养，但并未复原成整株植物。其他研究者也报道了体细胞胚发生和植物再生现象(Trolinder，N.L.and J.R.Goodin，In the Proc.of the Beltwide Cotton Production Research Conferences，January 6-11，1985，New Orleans，LA.P.46;and Mitten，D.H.In the Proc.of the Beltwide Cotton Production Research Conferences，January 6-11，1985，NewOrleans，LA.P.57-58)。这些方法未详细发表，但在其介绍的基础上，收集到足够的资料，以至一些论文开始涌现出来。某研究人员使用Coker 310栽培品种的未成熟胚和胚轴组织在加有植物激素NAA和2iP(或激动素)的MS培养基上进行培养，由此获得体细胞胚发生。虽然体细胞胚发生的迹象十分清楚，但从这些培养物中复原整株植物的迹象并不明显。其他实验者也提供了清楚和简明的原始实验记录，显示了完整植物复原的重视性。尽管他们能得到一些不同株系的体细胞胚，但最好的栽培品种属于Coker系谱的株系5110和312，以及一种Taxas原种T25。其他栽培品种则不能完成再生过程，亦即不能转化成整株植物，或者不能形成成熟的体细胞胚。他们的实验基本上都使用MS培养基、维生素B5、植物激素2，4-D和激动素。这些研究者始终将目标集中在体细胞非转化棉组织的植物再生上，但针对用遗传来设计植物株系的对策通常都涉及二个互补过程。第一个过程涉及一种或一种以上特定类型植物细胞的遗传转化。所谓转化是指将外来基因(一般是嵌合基因结构)引入各植物细胞的基因组中，而这种转化往往借助于一种能将有关基因转化到培养物中植物细胞基因组内的载体而完成的。然后第二个过程涉及将转化的植物细胞再生成为整株性成熟的植物。转化或再生过程均不必百分之百成功，但必须有较好的可靠性和再生性，以至有相当百分数的细胞可被转化或再生成整本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将基因引入棉株和其株系的方法，它包括将未成熟棉株的胚轴组织暴露在有转化能力的非致癌＊＊＊培养物中，该菌株含有一个具有Ｔ－ＤＮＡ区的Ｔｉ质粒，在所说Ｔ－ＤＮＡ区中包含一个外来嵌合基因和一个抗选择剂的基因。

【技术特征摘要】
US 1986-12-3 937,384书的范围内。 虽然本发明已结合最佳实施例作了描述，当然，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，可以进行各种变换和改变，对此，该技术领域内的熟练人员将是容易理解的。权利要求1.一种将基因引入棉株和其株系的方法，它包括将未成熟棉株的胚轴组织暴露在有转化能力的非致癌Agrobacterium tumefaciens培养物中，该菌株含有一个具有T-DNA区的Ti质粒，在所说T-DNA区中包含一个外来嵌合基因和一个抗选择剂的基因。2.根据权利要求1的方法，它进一步包括在选择剂存在下培养暴露组织，抗性基因为之编码，以获得抗性，从而选择用T-DNA区转化的植物细胞;在暴露于培养物内的组织中诱发体细胞胚的生成;将体细胞胚再生成完整的棉株。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是在所说暴露步骤前对棉籽进行表面消毒，然后使所说棉籽发芽，形成所说的未成熟棉株。4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说胚轴组织包括从所说的未成熟棉株上切除的胚轴分离块切片。5.根据权利要求1所述的方法，其特征是在所说Agrobacterium tumefaciens培养物含有一个双元Ti质粒体系，其中有毒性状被携带在一个从带有T-DNA区的质粒中分离出来的质粒上。6.根据权利要求5所述的方法，其特征是在所说的T-DNA区仅包括来自野生型Ti质粒中T-DNA的右边缘区和左边缘区。7.根据权利要求2所述的方法，其特征是所说的选择剂是抗菌素，而抗性基因进行编码，以获得对付抗菌素的抗性。8.根据权利要求7所述的方法，其特征是所说的耐抗菌素基因是NPTⅡ基因，而所说抗菌素选自由卡那霉素和G418所组成的组中的制剂。9.根据权利要求7所述的方法，其特征是所说的耐抗菌素基因是CAT基因，而所说抗菌素是氯霉素。10.根据权利要求7所述的方法，其特征是使用两种抗菌素和两种耐抗菌素的基因。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所说两种抗菌素选自由潮霉素、氯霉素以及卡那霉素或G418两者中的一种所组成的组中的制剂。12.根据权利要求1所述的方法，它进一步包括在组织暴露至所说的A...

【专利技术属性】
技术研发人员：保罗F厄佩卡，
申请(专利权)人：阿格拉塞特斯，
类型：发明
国别省市：US[美国]