一种猪生长抑素基因编辑位点及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪生长抑素基因编辑位点及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明专利技术将含有该编码序列的sgRNA和Cas9mRNA通过胞质显微注射法注入猪胚胎中，实现对猪SST基因的定点突变。本发明专利技术通过CRISPR‑Cas9技术在胚胎水平上对猪内源基因SST进行编辑。统计结果表明，该位点经过SSA luciferase检测体外酶切活性为65％，并能够在胚胎水平上面敲除猪SST基因，在细胞内形成SST的点突变。本发明专利技术对促进内源基因敲除或外源基因定点整合技术在转基因猪研究和生产中的应用具有十分重要的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种猪生长抑素基因编辑位点及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种猪生长抑素基因编辑位点及其应用，具体地说，涉及一种猪生长抑素基因SST编辑位点(30-52)及其应用。
技术介绍
将外源基因精准敲入猪基因组中，一直是极为困难的。常见的显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、逆转录病毒载体感染等方法由于其随机性无法实现外源基因在基因组特定位置的定点整合；依赖于同源重组的基因打靶技术虽然可以将外源基因导入靶细胞的特定位置，但其基因打靶效率低、操作难度大，而且在细胞筛选过程中引入的标记基因也会到来后期的生物安全隐患，这些问题都极大的限制了该技术的发展应用。直到近年来人工核酸内切酶(engineeredendonuclease,EEN)的出现，才彻底改变了这一现状。人工核酸内切酶技术，包括锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffctornuclease,TALEN)和CRISPR/Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas))技术。其中，以ZFN和TALEN为代表的技术能够实现基因组定点修饰，但具有一定的细胞毒性、操作过程复杂、脱靶率高，在哺乳动物基因组编辑中应用较少。CRISPR/Cas技术自问世以来深受科研工作者的喜爱，该技术在基因组定点修饰方面较其它技术有无可比拟的优势，操作简单、靶向精准度高，应用面广且费用低廉，经过三年来对技术的不断改进，目前该技术已被列为活细胞及个体水平最有效、最便捷的基因组定点修饰技术。猪生长抑素生长抑素(somatostatin，SST)是一种抑制生长激素分泌的神经调节肽，主要由下丘脑分泌，具有抑制生长激素释放的作用，同时对胰岛素、胰高血糖素、促甲状腺激素等的分泌也有抑制作用。猪与人类生活密不可分，是人类最主要的肉用家畜之一，它在组织解剖、生理代谢等方面与人更为接近，是研究人类疾病的理想动物模型。因此利用CRISPR/Cas9基因修饰技术敲除猪生长抑素基因，不仅有利于研究SST基因对猪生长发育、代谢及表达特征等方面的影响，进而在畜牧业生产上改良育种，提高猪生长率，也可作为实验动物模型进行生长抑制等相关疾病的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪生长抑素基因编辑位点及其应用，提供一个可高效敲除猪肌抑素基因(SST)的编辑位点(30-52)。该编辑位点可用于Cas9介导的猪SST基因打靶，将生长抑素基因功能失活，本专利技术针对SST基因设计筛选高效切割的sgRNA，并分析其突变效率，为构建SST基因内源性敲除或定点敲入外源基因的转基因猪提供新途径。一种猪生长抑素基因编辑位点，是一段包含23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该位点在猪基因组的准确定位是13号染色体SST编码区第一外显子上，染色体坐标为125337589-125337611，编码区坐标为30-52。一种猪生长抑素基因编辑位点在Cas9核酸内切酶特异识别过程中的应用。进一步，具体包括以下步骤：(1)从目的基因序列中通过PAM寻找合适的sgRNA靶位点，靶位点序列为：5’-GGCCGCGCTCTCCATCGTCCTGG-3’。(2)构建含有编辑靶位点(30-52)的sgRNA表达载体；(3)将上述载体进行体外转录获得sgRNA；(4)将上述sgRNA和Cas9mRNA按一定比例混合后共注射到猪激活后的孤雌胚中；(5)利用T7NE1酶切检测和TA克隆测序确认SST基因被修饰。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：利用本专利技术提供的编辑位点(30-52)，可以在核酸内切酶Cas9的介导下以较高效率进行双链断裂，然后通过非同源重组的方式在断裂位点出删除或增加碱基达到基因定点修饰的目的。本专利技术对促进内源基因敲除或外源基因定点整合技术在转基因猪研究和生产中的应用具有十分重要的作用。统计结果表明，该位点经过SSAluciferase检测体外酶切活性为65％，并能够在胚胎水平上面敲除猪SST基因，在细胞内形成SST的点突变。统计结果表明，本专利技术提供了针对猪生长抑素基因的sgRNA，为对该基因进行有效编辑提供了依据，为研制高瘦肉率的生猪新品种提供了新策略，也为探明生长抑素的分子机制和信号通路提供了可靠的手段和素材。附图说明图1pDR274-sgRNA表达载体示意图；以pDR274载体为骨架，用限制性内切酶BsaⅠ线性化pDR274质粒，与sgRNA寡核苷酸双链连接形成特异性表达载体pDR274-sgRNA；图2pDR274-sgRNA质粒测序结果；由pDR274-sgRNA质粒的测序结果可知，sgRNA寡核苷酸双链插入的位置和方向均正确，也即pDR274-sgRNA质粒构建成功；图3sgRNA和Cas9的体外转录；A图为SST-sgRNA体外转录图，100bpDNAladder(TaKaRa)；B图为Cas9mRNA体外转录图，5000bpDNAladder(TaKaRa)；图4T7EN1酶切结果；图5显微镜下各个时期的卵母细胞A：50倍显微镜下未培养的卵母细胞；B：50倍显微镜下48h后成熟卵母细胞；C：400倍显微镜下具有第一极体的卵母细胞；图6是显微镜下各个时期胚胎图；图中A：二细胞；B：四细胞；C：八细胞。激活后的卵母细胞经NCSU-23洗涤3次后转入覆盖有石蜡油的胚胎培养液中，培养皿置于39℃，5％CO2，100％湿度的恒温培养箱中。培养2天后，体视显微镜下观察记录细胞卵裂情况，统计分别处于不同发育时期的胚胎个数。分别是孤雌激活培养2天后二细胞和四细胞以及3天后的八细胞。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。实施例1CRISPR/Cas9特异性敲除猪SST基因中用于特异性靶向SST基因的sgRNA的设计和合成1.靶向猪SST基因的sgRNA的设计利用网站设计SST-sgRNA，具体步骤为：①登陆GenBank网站，搜索猪SST基因序列并下载，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。②打开靶点预测网站(http://crispr.mit.edu/)，利用靶位点在线设计工具“CRISPRdesigntool”，在文本框中输入基因序列，选择物种，即可得出该基因序列所有的靶位点，综合考虑各项参数后选取几组靶位点。③长20nt的寡核苷酸sgRNA核心序列按GG(N)19NGG序列进行设计。2.构建sgRNA的寡聚核苷酸根据选择的sgRNA，在正义链模板的5'端添加AAACACCG，与载体质粒黏性末端互补；反义链模板的5'端添加CTCTAAAAC，与载体质粒黏性末端互补。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸成对变性、退火，退火之后形成可以连入本试验中，针对SST基因设计1个sgRNAs作用靶点，其核苷酸序列见表1。表1实施例2sgRNA、Cas9mRNA的准备1.主要试剂：pmLM3613(AddgeneNo.42251)、BsaI、PmeI酶均购自NEB公司；MEGAshortscrip本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪生长抑素基因编辑位点，其特征在于，是一段包含23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该位点在猪基因组的准确定位是13号染色体SST编码区第一外显子上，染色体坐标为125337589‑125337611，编码区坐标为30‑52。

【技术特征摘要】
1.一种猪生长抑素基因编辑位点，其特征在于，是一段包含23个脱氧核糖核苷酸的DNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该位点在猪基因组的准确定位是13号染色体SST编码区第一外显子上，染色体坐标为125337589-125337611，编码区坐标为30-52。2.一种猪生长抑素基因编辑位点在Cas9核酸内切酶特异识别过程中的应用。3.根据权利要求2所述的猪生长抑素基因编辑位点在Cas9核酸内切酶特异识别过程中...

【专利技术属性】
技术研发人员：任红艳，毕延震，李晓敏，李莉，华再东，郑新民，刘西梅，肖红卫，华文君，张立苹，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42