固定化酶、其制备方法及其在修复莠去津污染土壤中的应用技术

本发明专利技术提供了一种固定化酶、其制备方法及其在修复莠去津污染土壤中的应用，属于微生物固定技术领域。该固定化酶的制备方法包括以下步骤：将HB‑5菌种破碎离心分离得到酶液；将酶液加入到壳聚糖的醋酸水溶液中搅拌均匀，随后滴入到氢氧化钠溶液中搅拌、过滤获得微球；将微球和海藻酸钠溶液混合后滴入氯化钙溶液中。本发明专利技术提供的固定化酶的制备方法工艺简单、操作方便，能够制备得到粒度大小均匀、结构稳定的吸附有酶的双层固定化球。本发明专利技术还提供了使用上述方法制备得到的固定化酶及其在修复莠去津污染土壤中的应用。

【技术实现步骤摘要】
固定化酶、其制备方法及其在修复莠去津污染土壤中的应用
本专利技术涉及微生物固定
，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及其在修复莠去津污染土壤中的应用。
技术介绍
莠去津(Atrazine)又名阿特拉津，化学名为2-氯-4-乙基胺-6-异丙基胺-1，3，5-均三氮苯，其是一种内吸选择性苗前、苗后封闭除草剂，其适于对玉米、高粱、茶园、果园和林地等防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草进行处理。但是随着莠去津的广泛应用，导致了严重的环境污染问题，其作为内分泌干扰抑制剂能够影响生物体内的正常代谢机制和形态发育，导致乳腺癌和卵巢癌的发生，为了解决莠去津污染问题，必须要对使用莠去津的土壤进行处理。目前现有的莠去津处理方法中以生物修复技术最具有发展前景，其由于高效环保的优点成为研究的热点，研究表明采用细菌降解莠去津具有较高的价值，微生物可以利用莠去津作为碳源和氮源，从而使莠去津分子脱烷基、脱N-烷基及三氮环裂解，释放出二氧化碳并彻底矿化降解，由于微生物降解莠去津的过程是由酶驱动，为了提高莠去津降解的效果，需要将酶固定于载体上以产生长效降解效果，因此，需要一种能够长时间稳定存在以降解土壤中莠去津污染物的固定化酶产物。
技术实现思路
本专利技术提供了一种固定化酶的制备方法，其具有工艺简单、操作方便的优点。本专利技术还提供了一种固定化酶，其具有粒度均匀，结构稳定的优点，且能够在土壤中缓慢降解以露出内部负载的莠去津降解酶。本专利技术还提供了上述固定化酶在修复莠去津污染土壤中的应用。本专利技术是这样实现的：一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：将HB-5菌种破碎离心分离得到酶液；将酶液加入到壳聚糖的醋酸水溶液中搅拌均匀，随后滴入到氢氧化钠溶液中搅拌、过滤获得微球；将微球和海藻酸钠溶液混合后滴入氯化钙溶液中。在本专利技术较佳的实施例中，上述HB-5菌种按2％～4％的接种量使用液体培养基在28～35℃下培养48h以上，随后进行破碎离心分离作业，液体培养基包含蔗糖3～5g/L，酵母浸膏1～3g/L，K2HPO41.6～2.5g/L，KH2PO40.4～0.6g/L，MgSO4·7H2O0.2～0.5g/L，NaCl0.1～0.4g/L，微量元素溶液2～4mL/L，莠去津100～300mg/L。在本专利技术较佳的实施例中，上述微量元素溶液包含EDTA2～2.5g/L，FeSO4·7H2O1～2g/L，ZnSO4·7H2O3～5g/L，MnSO4·H2O1～2g/L，CuSO4·5H2O0.4～0.8g/L，Na2B4O7·10H2O0.2～0.5g/L，Na2MoO4·2H2O0.25～0.5g/L。在本专利技术较佳的实施例中，上述破碎离心分离是将HB-5菌种在4℃下于8000～9000rpm离心8～12min后收集菌体，并用0.05～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤1～3次后于8000～9000rpm二次离心8～12min收集菌体，随后将收集的菌体和磷酸盐缓冲液按1g：2～3mL的比例混合后冰水浴超声波破碎10～20min后在4℃下于9000～10000rpm离心15～20min收集上清液，超声功率为280～350W。在本专利技术较佳的实施例中，上述超声波破碎时，每破碎5～20s，间隔5～20s。在本专利技术较佳的实施例中，上述壳聚糖的醋酸水溶液中壳聚糖的质量分数为2％～5％，酶液和壳聚糖的质量比为1：30～40，氢氧化钠溶液的质量分数为5％～10％。在本专利技术较佳的实施例中，上述氢氧化钠溶液中含有质量分数1％～2％的烷基磺酸盐。在本专利技术较佳的实施例中，上述微球和质量浓度3％～5％的海藻酸钠溶液按1：25～40的质量比混合后滴入质量分数4％～8％的氯化钙溶液中。本专利技术还提供了一种固定化酶，其是采用上述的固定化酶的制备方法制备得到。本专利技术还提供了上述的固定化酶在修复莠去津污染土壤中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的固定化酶的制备方法包括以下步骤：将HB-5菌种破碎离心分离得到酶液；将酶液加入到壳聚糖的醋酸水溶液中搅拌均匀，随后滴入到氢氧化钠溶液中搅拌、过滤获得微球；将微球和海藻酸钠溶液混合后滴入氯化钙溶液中。本专利技术提供的固定化酶的制备方法工艺简单、操作方便，能够制备得到粒度大小均匀、结构稳定的吸附有酶的双层固定化球。本专利技术还提供了使用上述方法制备得到的固定化酶，其具有粒度均匀、结构稳定性强的优点，该固定化酶能够在土壤中缓慢降解以露出内部负载的莠去津降解酶进行净化作业。本专利技术还提供了上述固定化酶在修复莠去津污染土壤中的应用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为使用实施例1制备的酶液和固定化酶在棕壤土中降解莠去津的效果对比图；图2为使用实施例2制备的酶液和固定化酶在棕壤土中降解莠去津的效果对比图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例进行具体说明。本实施例提供了一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：S1、将HB-5菌种破碎离心分离得到酶液；优选的，HB-5菌种按2％～4％的接种量使用液体培养基在28～35℃下培养48h以上，随后进行破碎离心分离作业，液体培养基包含蔗糖3～5g/L，酵母浸膏1～3g/L，K2HPO41.6～2.5g/L，KH2PO40.4～0.6g/L，MgSO4·7H2O0.2～0.5g/L，NaCl0.1～0.4g/L，微量元素溶液2～4mL/L，莠去津100～300mg/L。其中，微量元素溶液优选包含EDTA2～2.5g/L，FeSO4·7H2O1～2g/L，ZnSO4·7H2O3～5g/L，MnSO4·H2O1～2g/L，CuSO4·5H2O0.4～0.8g/L，Na2B4O7·10H2O0.2～0.5g/L，Na2MoO4·2H2O0.25～0.5g/L。进一步优选的，破碎离心分离是将HB-5菌种在4℃下于8000～9000rpm离心8～12min后收集菌体，并用0.05～0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤1～3次后于8000～9000rpm二次离心8～12min收集菌体，随后将收集的菌体和磷酸盐缓冲液按1g：2～3mL的比例混合后冰水浴超声波破碎10～20min后在4℃下于9000～10000rpm离心15～20min收集上清液，超声功率为280～350W；超声波破碎时，优选每破碎5～20s，间隔5～20s。S2、将酶液加入到壳聚糖的醋酸水溶液中搅拌均匀，滴入到氢氧化钠溶液中搅拌、过滤获得微球；优选的壳聚糖的醋酸水溶液中壳聚糖的质量分数为2％～5％，酶液和壳聚糖的质量比为1：30～40，氢氧化钠溶液的质量分数为5％～10％；氢氧化钠溶液中优选含有质量分数1％～2％的烷基磺酸盐；干燥优选是30～40℃下烘干。S3、将微球和海藻酸钠溶液混合后滴入氯化钙溶液中。优选的，微球和质量浓度3％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将HB‑5菌种破碎离心分离得到酶液；将所述酶液加入到壳聚糖的醋酸水溶液中搅拌均匀，随后滴入到氢氧化钠溶液中搅拌、过滤获得微球；将所述微球和海藻酸钠溶液混合后滴入氯化钙溶液中。

【技术特征摘要】
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将HB-5菌种破碎离心分离得到酶液；将所述酶液加入到壳聚糖的醋酸水溶液中搅拌均匀，随后滴入到氢氧化钠溶液中搅拌、过滤获得微球；将所述微球和海藻酸钠溶液混合后滴入氯化钙溶液中。2.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述HB-5菌种按2％～4％的接种量使用液体培养基在28～35℃下培养48h以上，随后进行所述破碎离心分离作业，所述液体培养基包含蔗糖3～5g/L，酵母浸膏1～3g/L，K2HPO41.6～2.5g/L，KH2PO40.4～0.6g/L，MgSO4·7H2O0.2～0.5g/L，NaCl0.1～0.4g/L，微量元素溶液2～4mL/L，莠去津100～300mg/L。3.根据权利要求2所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述微量元素溶液包含EDTA2～2.5g/L，FeSO4·7H2O1～2g/L，ZnSO4·7H2O3～5g/L，MnSO4·H2O1～2g/L，CuSO4·5H2O0.4～0.8g/L，Na2B4O7·10H2O0.2～0.5g/L，Na2MoO4·2H2O0.25～0.5g/L。4.根据权利要求1所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述破碎离心分离是将所述HB-5菌种在4℃下于8...

【专利技术属性】
技术研发人员：马婷婷，周炜，朱鲁生，
申请(专利权)人：湖北文理学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42