细胞的条件性永生化制造技术

一种重组的、或遗传工程的哺乳动物细胞，含有一种条件性诱导癌基因和一种编码端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。这种重组细胞可用于治疗，以代替缺失的或损伤的细胞。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于治疗性应用的哺乳动物细胞的永生化。
技术介绍
人们对于移植疗法治疗组织和器官损伤的重要性的认识和理解正在不断增加。而当器官移植正在被广泛实施的时候，以单个细胞移植为基础的移植疗法仍然处于临床发展的相对早期。举例来说，人们正在不断增加关于将合适的细胞移植进受损伤的大脑可能改进或纠正任何由损伤所引起的知觉、运动、行为、心理上的缺损的认识。要使以细胞为基础的疗法得以应用，就一定要有可能获得充足的可供移植的细胞。确保这一点的一个方法是在允许重复细胞分裂和生长的条件下培养未分化细胞。使用未分化细胞的一个困难之处是不受调节的细胞分裂一定要在细胞移植进入患者体内之前或之时被关闭掉，以避免它在移植部位不受抑制地生长。人们发展了许多不同的技术以提供合适的细胞供移植使用。关于神经移植的一项研究是在允许发生细胞分裂的条件下维持培养未分化的胎儿细胞，随即在移植之前，在体外诱导分化。Reynolds和Weiss，科学(Science)，1992；2551707，表明使用上皮生长因子(EGF)可以在体外诱导成年鼠脑细胞增殖。据认为在合适的条件下，该细胞可以被诱导分化为星形胶质细胞和神经元。国际专利申请WO-A-94/16059号透露了一项体外维持原代神经细胞培养的技术，就是在补充了至少一种营养因子的无血清培养基中培养该细胞。国际专利申请WO-A-97/10329号透露了另一项备选技术，就是使用条件性永生细胞系。该细胞系含有一个永生化温度敏感癌基因，该癌基因在允许情况下，维持神经上皮干细胞处于未分化状态。移植后，由于人的体温较高(37℃)，癌基因被关闭，并且细胞也分化成所需要的细胞类型以修补损伤。使用癌基因的优点是能使细胞维持在未分化状态直到移植，此时，细胞对应于特有的损伤，分化为受损伤或丢失的细胞的表型。美国专利5688692也展示了表达非DNA结合的、温度敏感的T抗原的细胞。然而应当承认，虽然表达癌基因的人类细胞的生命得以延长，但是它们仍然会停止分裂并最终经历极期(细胞死亡)。也有人建议通过整合人的端粒末端转移酶催化亚基的外源拷贝而重建端粒末端转移酶活性，从而使人类细胞永生化(Bodnar等，科学(Science)，1998；279249-252)。端粒末端转移酶起着维持染色体末端的端粒的作用，而且人们相信正是在细胞复制期间端粒的逐渐缩短促成了衰老，因此重新构建了端粒末端转移酶以使细胞永生化。人的端粒末端转移酶现在已经被用来使许多不同类型的细胞永生化。Counter等，PNAS(美国)，1998；95(25)4723-14728，也表明端粒末端转移酶催化亚基(hTERT)的异常表达能允许终末衰老细胞增殖，超越极期而达到细胞永生化。被研究的细胞是用表达SV40 T抗原的癌基因转化的。然而，作者推断单独hTERT表达可能足以使细胞永生化，而且hTERT的激活作用可能是肿瘤进展的一个关键性步骤。因此，该文章的综合结论就是用hTERT转化细胞会使细胞永生化。这意味着这样的细胞不适合用于移植疗法。因此，尽管许多上述公开的技术可能是有用的，但仍然需要某些方法，以获得在移植之前保留无限增殖能力，而在移植后则失去无限增殖能力的细胞。专利技术概述本专利技术的基础是实现了用条件性诱导癌基因和至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基转导的细胞在允许条件下是可以无限增殖的，但在非允许条件下则失去无限增殖性。依照本专利技术的一个方面，重组或遗传工程哺乳动物细胞包含条件性诱导或温度敏感癌基因，和编码至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。依照本专利技术的第二方面，重组多核苷酸结构包含编码至少端粒末端转移酶复合物催化亚基的基因，和条件性诱导或温度敏感的癌基因。依照本专利技术的第三方面，使哺乳动物细胞永生化的方法包括在正在增殖的哺乳动物细胞中引入条件性诱导癌基因和编码端粒末端转移酶基因催化亚基的外源性多核苷酸。依照本专利技术的第四方面，本专利技术的细胞可以用在治疗方面，特别是用于制造药物，以治疗与细胞丧失或损伤有关的疾病。举例来说，神经上皮干细胞可以用于治疗与脑损伤有关的病症，例如阿尔茨海默氏病。已经发现本专利技术的细胞保持高度的稳定性以及在非允许温度下不能无限增殖。这是一个令人惊讶的和重要的发现，正如预期的那样，它是在现有技术的基础上，为了使细胞维持永生化，通过重构端粒末端转移酶活性而完成的。然而，看来虽然编码端粒末端转移酶基因是组成型的，但是端粒末端转移酶并不起着保持永生性的作用。条件性的保留和稳定性的增加，使本专利技术的细胞适合经过连续的传代而获得供移植使用的细胞系。附图描述以下附图用于阐述本专利技术。附图说明图1是含有hTERT和编码SV40大T抗原的温度敏感癌基因的多核苷酸结构的示意图；和图2是备选结构的示意图，其中hTERT和癌基因的顺序与图1的结构有所不同。专利技术描述本专利技术公开了制备适合移植疗法的细胞的方法，直到移植的时候，该细胞都可以无限增殖。该细胞内需要存在条件性诱导癌基因。在此使用的术语“条件性诱导”是与癌基因有关的，即它的表达在确定的情况下可以被调节。癌基因将会在所谓的允许条件被满足的时候表达。举例来说，一些癌基因是温度敏感的，只有在环境温度低于某一个确定值时才会表达。在本专利技术的一个实施方案中，所使用的癌基因是非DNA结合的、温度敏感的、SV-40大T抗原基因的突变体(U19tsA58)。合适的备选基因也是已知的并包括多瘤病毒T抗原癌基因。细胞也需要编码至少端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。在此使用的术语“外源性”在它的正常上下文中指的是被导入细胞的多核苷酸，并与自然存在的内源性多核苷酸相区别。端粒末端转移酶复合物的催化亚基是一个具有逆转录酶活性的酶，在本领域广为人知。人亚单位公开在GB-A-2317891中。癌基因和编码端粒末端转移酶的多核苷酸可以被包含在重组DNA或逆转录病毒载体或结构中，以转导/感染细胞。这两个成分可以被引入同一个载体，或每个成分也可以分别包含在单独的载体内。本专利技术的载体或结构可能进一步包含合适的启动子区域以起始DNA转录，以及可用来识别那些被转化/感染的细胞的选择性标记。表达的调节可以用技术人员所熟知的方法来完成。举例来说，可以使用长末端重复(LTR)启动子进行调节。备选启动子对技术人员而言也是很明确的。举例来说，使用巨细胞病毒(CMV)启动子进行调节可能是有效的。CMV启动子是一个很强的启动子，当所用的细胞是神经细胞，例如神经上皮干细胞时，它可以作为优选启动子。将合适的结构导入细胞的方法也是技术人员所熟知的。任何哺乳动物细胞都可能用于本专利技术中。举例来说，所选用的细胞可能是内皮细胞，并可以被用于腿部，心和其他的器官的血管再生成。优选的细胞是人的体细胞，例如人的上皮干细胞，它能够分化成特殊的细胞类型。特别优选细胞是人的神经上皮干细胞，它可用于神经移植，修补细胞损失或损伤，并且纠正行为或心理上的缺陷。备选细胞也可以是分化了的细胞，例如胰岛的β细胞。另外的备选细胞可能包括但不限于可来自内分泌腺的细胞、视网膜细胞、耳蜗细胞、肝细胞、成骨细胞和破骨细胞、成肌细胞和角质形成细胞。癌基因和端粒末端转移酶优选在培养早期、通常是在最初10次细胞分裂以内被引入细胞内。癌基因和端粒末端转移酶导入细胞的顺序并不是本方法成功与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种哺乳动物细胞，其包含条件性诱导的癌基因和编码端粒末端转移酶复合物的催化亚基的外源性多核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P杰特，
申请(专利权)人：兰诺龙有限公司，勒德维格癌症研究院，
类型：发明
国别省市：GB[英国]