一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法技术

本发明专利技术建立了一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法，利用免疫磁性纳米材料的光热效应建立了温度升高值与鼠伤寒沙门氏菌数目间的标准曲线，可将样品产生的温度升高值带入标准曲线得到样品中的细菌数目。同时，利用免疫磁性纳米材料的磁性与光热效应，实现了富集分离‑检测‑试样灭活三个环节的有效整合，本方法灵敏、安全、快速、便携、成本低，经实验验证，基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌方法最低检测限为300个细菌，且温度升高值ΔT与细菌数目在300～1000范围内成线性相关关系，因此本发明专利技术具有良好的实际应用前景，可应用于对鼠伤寒沙门氏菌的实际快速检测。

A rapid detection method for Salmonella typhimurium based on the photothermal effect of immunomagnetic nanomaterials

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法
本专利技术涉及免疫检测
，特别涉及一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法。
技术介绍
由食源性致病菌引起的食品安全问题一直是世界卫生组织及各国政府高度重视的全球性问题，也是食品安全管理与控制的核心与难点之一。沙门氏菌病是重要的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，可引起食物中毒。当前沙门氏菌的检测方法一般均需增殖步骤，以增加病原的可检出率，费时费力，需4～7天才能完成，无法及时、快速评价食品中沙门氏菌的含量。目前利用菌体或鞭毛抗原特异性抗体的免疫学方法是快速检测方法的主要研究方向。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有酶联免疫法、荧光免疫法、放射免疫法、免疫传感器等，此类方法可以酶标板、试纸条、膜或电极等作为固定载体。其中，基于试纸条或膜的方法最为简单快速，无需大型仪器，适用于定性或半定量分析。由于多数待测样本为阴性，对于大样本量的快速定性或半定量筛查能大大提高检测效率，因此，此类快速检测方法非常适用于大样本量快速筛查。但由于此类方法大多采用目视或简易检测设备，灵敏度仍然相对较低，只有提高灵敏度，再配以用于富集净化的前处理步骤才能适用于复杂基质的食品样品中沙门氏菌的快速筛查。由上述分析可知，目前绝大部分致病菌检测方法是将富集分离-检测-试验灭活分为三个环节进行，步骤多，耗时长，且目前多数关于分析时间的报道只涉及检测这一环节，而从样品处理至试样灭活整个分析过程所需时间不少于2h，若需增菌环节将不少于10h，且现有致病菌检测方法的检测灵敏度仍有待提高。有鉴于此，亟需提供一种对沙门氏菌灵敏、安全、快速、便携、低成本的检测方法。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，专利技术人提供一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法，该方法采用免疫磁性纳米材料同时实现对鼠伤寒沙门氏菌捕获、检测及灭活，同时利用激光照射免疫磁性纳米材料产生的温度变化，建立温度升高值与鼠伤寒沙门氏菌数目的标准曲线，实现对鼠伤寒沙门氏菌的定量检测。具体的，本专利技术涉及以下技术方案：本专利技术的第一个方面，公开了免疫磁性纳米材料在鼠伤寒沙门氏菌快速检测中的应用。将所述免疫磁性纳米材料添加到鼠伤寒沙门氏菌中，具体的，通过在羧基磁珠上标记抗鼠伤寒沙门氏菌抗体从而制得免疫磁性纳米材料，进而与鼠伤寒沙门氏菌进行偶联，实现对鼠伤寒沙门氏菌捕获。其中，所述免疫磁性纳米材料的制备方法为：1)取羧基磁珠，超声，磁分离，用双蒸水清洗；向其中加入EDC/NHS溶液，在室温条件下活化，再进行磁分离，用PBS溶液反复清洗后得活化后磁珠；2)向活化后的磁珠中加入抗鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温条件下反应一段时间，磁分离，然后用PBS溶液反复清洗，得免疫磁性纳米材料。其中，所述羧基磁珠的粒径为10～300nm(优选为200～300nm)；该粒径下获得的免疫磁性纳米材料光热效应最佳，同时磁分离时间短，且对细菌的非特异吸附低。本专利技术的第二个方面，公开了一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法，其具体步骤包括：S1.将羧基磁珠与抗鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联得免疫磁性纳米材料；S2.将步骤S1.制备得到的免疫磁性纳米材料添加至鼠伤寒沙门氏菌中，孵育，膜过滤，并用磁分离技术进一步纯化，得鼠伤寒沙门氏菌-免疫磁性纳米材料复合物；S3.用激光对截留在膜上的鼠伤寒沙门氏菌-免疫磁性纳米材料复合物照射，产生温度变化，根据温度升高值和细菌数目建立标准曲线；同时基于免疫磁性纳米材料的光热效应，同步对鼠伤寒沙门氏菌进行灭活。其中，步骤S1.免疫磁性纳米材料具体制备方法为：S1.1取羧基磁珠，超声，磁分离，用双蒸水清洗；向其中加入EDC/NHS溶液，在室温条件下活化，再进行磁分离，用PBS溶液反复清洗后得活化后磁珠；S1.2向活化后的磁珠中加入抗鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温条件下反应一段时间，磁分离，然后用PBS溶液反复清洗，得免疫磁性纳米材料。其中，步骤S1.1中所述羧基磁珠的粒径为10～300nm(优选为200～300nm)；该粒径下获得的免疫磁性纳米材料光热效应最佳，同时磁分离时间短，且对细菌的非特异吸附低；步骤S2.中免疫磁性纳米材料的添加量为9～10μg/1000个鼠伤寒沙门氏菌(优选为10μg/1000个鼠伤寒沙门氏菌)，免疫磁性纳米材料添加量过低或过高，均会导致光热效应较低，影响实验结果；所述步骤S3.中激光功率为2.5～2.8W·cm-2(优选2.5W·cm-2)，波长为808nm，照射时间为2～5分钟(优选为2分钟)；照射功率过低，则免疫磁性纳米材料升温缓慢，延长检测时间和灭活时间；照射功率过高，则免疫磁性纳米材料升温过高会对滤膜产生破坏；所述步骤S3.中根据温度升高值和细菌数目建立标准曲线具体使用公式如下：ΔT＝ΔT1-ΔT0其中，ΔT为温度升高值ΔT0为空白(未添加鼠伤寒沙门氏菌)样品激光照射前后的温度升高值。ΔT1为添加样品后激光照射前后的温度升高值。为了消除截留在滤膜上多余免疫磁性纳米材料的影响，故应将空白(未添加鼠伤寒沙门氏菌)样品激光照射前后的温度升高值(ΔT0)从添加样品后激光照射前后的温度升高值(ΔT1)中扣除；本专利技术还公开了上述检测方法在快速检测鼠伤寒沙门氏菌中的应用，具体的，所述应用方式为对饮用水中鼠伤寒沙门氏菌进行快速检测。本专利技术的有益效果：本专利技术建立了一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法，利用免疫磁性纳米材料的光热效应建立了温度升高值与鼠伤寒沙门氏菌数目间的标准曲线，可将样品产生的温度升高值带入标准曲线得到样品中的细菌数目。同时，利用免疫磁性纳米材料的磁性与光热效应，实现了富集分离-检测-试样灭活三个环节的有效整合，即利用一种纳米材料同时实现致病菌的磁富集、光热检测及试样的光热灭活三种功能，将总分析时间缩短至1.5h以内；本方法灵敏、安全、快速、便携、成本低，经实验验证，基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌方法最低检测限为300个细菌，且温度升高值ΔT与细菌数目在300～1000范围内成线性相关关系，因此本专利技术具有良好的实际应用前景，可应用于对鼠伤寒沙门氏菌的实际快速检测。附图说明图1A为免疫磁性纳米材料识别鼠伤寒沙门氏菌示意图；图1B为基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌捕获及光热效应检测过程示意图；图2为不同粒径羧基磁珠在不同浓度下的光热效应图；图3为不同粒径羧基磁珠磁分离时间的比较图；图4为不同粒径羧基磁珠对鼠伤寒沙门氏菌非特异性吸附图；图5为鼠伤寒沙门氏菌偶联免疫磁性纳米材料透射电子显微镜图；图6为荧光染色鼠伤寒沙门氏菌偶联荧光免疫磁性纳米材料荧光图；图7(A)为不同激光照射功率与羧基磁珠升温关系图，图7(B)不同激光照射时间与羧基磁珠升温关系图；图8为免疫磁性纳米材料添加量与其光热效应关系图；图9(A)为PBS与饮用水中ΔT与沙门氏菌数目的标准曲线图，图9(B)为饮用水中沙门氏菌的检测结果图；图9(C)为本专利技术的方法特异性考察图，分别针对沙门氏菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行考察。图10为孵育羧基磁珠经激光不同辐照时间后对鼠伤寒沙门氏菌的杀菌效果图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫磁性纳米材料在鼠伤寒沙门氏菌快速检测中的应用。

【技术特征摘要】
1.免疫磁性纳米材料在鼠伤寒沙门氏菌快速检测中的应用。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述免疫磁性纳米材料的制备方法为：1)取羧基磁珠，超声，磁分离，用双蒸水清洗；向其中加入EDC/NHS溶液，在室温条件下活化，再进行磁分离，用PBS溶液反复清洗后得活化后磁珠；2)向活化后的磁珠中加入抗鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温条件下反应一段时间，磁分离，然后用PBS溶液反复清洗，得免疫磁性纳米材料。3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述羧基磁珠的粒径为10～300nm(优选为200～300nm)。4.一种基于免疫磁性纳米材料光热效应的鼠伤寒沙门氏菌快速检测方法，其特征在于，包括：S1.将羧基磁珠与抗鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联得免疫磁性纳米材料；S2.将步骤S1.制备得到的免疫磁性纳米材料添加至鼠伤寒沙门氏菌中，孵育，膜过滤，并用磁分离技术进一步纯化，得鼠伤寒沙门氏菌-免疫磁性纳米材料复合物；S3.用激光对截留在膜上的鼠伤寒沙门氏菌-免疫磁性纳米材料复合物照射，产生温度变化，根据温度升高值和细菌数目建立标准曲线；同时基于免疫磁性纳米材料的光热效应，同步对鼠伤寒沙门氏菌进行灭活。5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤S1.免疫磁性纳米材料具体制备方法为：S1.1取羧基磁珠，超声，磁分离，用双...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿雁，张震，罗钰，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37