一种基于N制造技术

本发明专利技术公开了一种基于N

One based on N

The invention discloses one kind based on N

【技术实现步骤摘要】
一种基于Npro蛋白检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒
本专利技术涉及兽医免疫检测领域，更具体地，涉及一种基于Npro蛋白检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒。
技术介绍
仔猪先天性震颤发生于新生仔猪，特征是仔猪在出生后观察到骨骼肌阵挛收缩，出现震颤现象，症状严重的会因饥饿而导致死亡。2015年，Hause研究小组证实了猪非典型瘟病毒(Atypicalporcinepestivirus，APPV)是仔猪先天性震颤的病原。随后，德国、荷兰、奥地利等多个国家先后发现猪群存在APPV流行。华南农业大学宁章勇课题组首次发现了我国猪群APPV感染的发生，并分离了APPVGD1和GD2毒株，但是到目前为止我国猪群APPV流行的情况仍然不清楚。目前对于猪非典型瘟病毒感染尚无疫苗可以应用，所以目前缺乏检测猪非典型瘟病毒抗体的相关试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种基于Npro蛋白检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，包括SEQIDNO.1所示序列的猪非典型瘟病毒Npro蛋白包被的反应板、酶标抗体、显色液、终止液、阳性血清和阴性血清。优选地，所述猪非典型瘟病毒Npro蛋白的制备方法为：将SEQIDNO.2所示序列的猪非典型瘟病毒Npro基因克隆至原核表达载体上，将得到的重组原核表达载体转化感受态细胞，筛选阳性重组菌株，诱导阳性重组菌株获得Npro蛋白。优选地，所述原核表达载体为pET-32a(+)。优选地，所述感受态细胞为BL21大肠杆菌。优选地，使用IPTG诱导阳性重组菌株表达目的蛋白，IPTG终浓度为1.0mmol/L、温度为37℃条件下诱导表达8小时。优选地，所述包被方法为：10μg/mL的Npro蛋白按每孔100μL加入反应板中，4℃过夜包被，次日PBST洗板3次，拍干。优选地，所述显色液为TMB，所述终止液为浓度2mol/L的H2SO4。优选地，所述酶标抗体为HRP标记兔抗猪IgG。优选地，所述阳性血清为通过猪非典型瘟病毒攻毒后的猪血清；阴性血清为健康猪血清。优选地，诱导阳性重组菌株后，收集菌液，将菌液在12000r/min条件下离心3min，菌体用PBS按1:10（V/V）重悬。将悬浮菌液在冰浴条件下超声破碎60次菌体破碎条件为，冰浴条件下超声破碎60次，3sec/次，每次间隔5sec。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次创建了检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，而且该试剂盒可快速、特异、灵敏地检测血清中猪非典型瘟病毒的抗体。具体体现在，该检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒特异性强：对已知其他病毒的阳性血清进行交叉反应的检验，所有待检血清与APPV阴性血清的比值（P/N值）均小于2.1；重现性好：批内和批间的重复性检验，变异系数均在5%以内；敏感度高：其检测血清抗体灵敏度为1：1000；准确性高：阳性检出率与采用荧光定量PCR方法检测的结果完全吻合。本专利技术试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，适用于猪非典型瘟病毒感染的监测、流行病学调查以及兽医临床样本的检测，适合大范围推广应用。目前对于猪非典型瘟病毒感染尚无疫苗可以应用，所以检测猪非典型瘟病毒血清抗体的存在对判定猪只的感染及采取相应的处理措施具有重要意义。由于猪非典型瘟病毒在我国是新发现的病原，目前还没有血清抗体的检测方法。本专利技术首次将Npro重组表达蛋白（大肠杆菌原核表达蛋白）运用到APPV检测中。虽然利用真核表达系统可以将猪非典型瘟病毒Npro蛋白表达的更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能，但是本专利技术还是选择了大肠杆菌表达系统，原因在于，大肠杆菌表达的重组蛋白抗原易于制备和纯化，而且表达重组蛋白抗原的宿主细胞大肠杆菌比制备APPV抗原的宿主细胞（如PK15等猪源细胞）与APPV的宿主（猪）亲缘关系更远，检测时产生非特异性的可能性也减少。附图说明图1为APPVGD1株的Npro基因PCR扩增产物电泳结果（M：DL2000DNAMarker，1：Npro基因PCR产物）。图2为APPVGD1株的Npro基因质粒构建过程中双酶切鉴定结果（M：DL5000DNAMarker，1：EcoRI/XhoI双酶切条带）。图3为Npro蛋白的诱导表达结果（M：蛋白质Marker，1：pET-32a(+)空载体诱导表达产物，2：pET-32a(+)空载体不诱导表达产物，3：pET-32a/APPV-Npro重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞诱导表达产物，4：pET-32a/APPV-Npro重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞不诱导表达产物）。图4为Npro蛋白Western-blot检测及纯化蛋白电泳结果（A为Npro蛋白的免疫印迹检测结果，M：蛋白质Marker，1：Npro蛋白免疫印迹；B为SDS-PAGE检测纯化的Npro蛋白，M：蛋白质Marker，1：纯化的Npro蛋白）。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一种检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括猪非典型瘟病毒Npro蛋白包被的反应板、酶标抗体、显色液、终止液、阳性血清和阴性血清。其中，猪非典型瘟病毒Npro蛋白包被的反应板的制备方法如下：一、猪非典型瘟病毒Npro蛋白的获得：1、克隆猪非典型瘟病毒Npro基因：根据APPVGD1株（GenBank：KX950761）的基因序列设计扩增Npro基因的引物，具体引物如下：F1：5′-GCGGCGGAATTCATGAAGAAGCAGATTACAT-3′（SEQIDNO：3），下划线表示EcoRI酶切位点；R1：5′-GCGATGCTCGAGTTAACAGGTCTTCACATAAAGC-3′（SEQIDNO：4），下划线表示XhoI酶切位点。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。血清样本按照TRIzol试剂盒的说明进行总RNA提取。参照PrimeScript™II1stStrandcDNASynthesisKit说明进行反转录cDNA，后冻存于-80℃超低温冰箱备用。cDNA的合成：按照PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit的使用说明书，在0.2mLPCR管中加入下列试剂：在PCR仪上进行变性反应：65℃，5min，冰上急冷。在上述PCR管中加入下列反转录反应液：PCR反应程序：42℃60min；70℃15min；50℃1min。PCR扩增：以上述得到的cDNA为模板进行扩增，PCR反应体系如下：PCR程序为:94℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火40sec，72℃延伸30sec，30个循环，最后72℃延伸10min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果（图1）显示，扩增获得567bp的片段（不包括酶切位点、终止密码子和保护性碱基则为540bp），与预期本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括SEQ ID NO.1所示序列的猪非典型瘟病毒N

【技术特征摘要】
1.一种检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括SEQIDNO.1所示序列的猪非典型瘟病毒Npro蛋白包被的反应板、酶标抗体、显色液、终止液、阳性血清和阴性血清。2.根据权利要求1所述的检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述猪非典型瘟病毒Npro蛋白的制备方法为：将SEQIDNO.2所示序列的猪非典型瘟病毒Npro基因克隆至原核表达载体上，将得到的重组原核表达载体转化感受态细胞，筛选阳性重组菌株，诱导阳性重组菌株获得Npro蛋白。3.根据权利要求2所述的检测猪非典型瘟病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，原核表达载体为pET-32a(+)。4.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁章勇，刘健新，许古明，郭世宁，张凯照，葛士坤，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44