分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法制造技术

本方法采用琼脂糖凝胶偶联ｐ－氨基苯甲脒配基制备亲和层析柱，从蚯蚓的匀浆液中分离纯化出具有较强纤溶活力的单组分蛋白酶。通过该亲和层析柱，用含有脲基及胍基的化合物制备洗脱液进行梯度洗脱，经透析或分子筛等方法脱盐，得到其中的ＥＦＥ－ＩＩＩ纤溶蛋白酶，它具有很强的纤维蛋白溶解活力。用该方法纯化来源于各种蚯蚓的纤溶蛋白酶具有简洁方便，成本低等特点，适用于实验室和规模化生产。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分离纯化单组分蚯蚓纤溶蛋白酶(蚓激酶)的方法，特别是涉及一种采用羰基二咪唑或溴化氰活化琼脂糖树脂，偶联p-氨基苯甲脒的亲和层析柱，从中分离纯化出纤溶酶中有较高纤溶活性的EFE-III组分的技术与方法。
技术介绍
近年来人们采用盐析、超滤、分子筛、离子交换、高压液相色谱等分离方法(目前国外有文章如文献1Nakajima，N.，Mihara，H.and Sumi，N.(1993)Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm，Lumbricus rubellus.Biosci.Biotech.Biochem.57，1726-1730。文献2Nakajima，N.，Sugimoto，M.，and Ishihara，K.(2000)Stable earthworm serine proteasesApplication of the protease function andusefulness of the earthworm autolysate.Journal of Bioscience 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于以ｐ－氨基苯甲脒为配基，包括以下步骤： １） 用羰基二咪唑或溴化氰活化琼脂糖填料： ａ．用羰基二咪唑活化琼脂糖填料：在沙芯漏斗中充分清洗琼脂糖，以除去有机相；用浓度递增的二氧六环逐渐转入有机相；将羰基二咪唑溶于二氧六环中，同琼脂糖混合搅拌；再用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中； ｂ．用常规的溴化氰方法活化琼脂糖填料； ２） 采用ｐ－氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基：将ｐ－氨基苯甲脒和缩合剂１－乙基－３－碳二亚胺盐酸盐溶解在ＮａＨＣＯ↓［３］溶液中，然后与活化后的琼脂糖填料按体积比１∶１０～１∶５混合，于室温...

【技术特征摘要】
1.一种分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于以p-氨基苯甲脒为配基，包括以下步骤1)用羰基二咪唑或溴化氰活化琼脂糖填料a.用羰基二咪唑活化琼脂糖填料在沙芯漏斗中充分清洗琼脂糖，以除去有机相；用浓度递增的二氧六环逐渐转入有机相；将羰基二咪唑溶于二氧六环中，同琼脂糖混合搅拌；再用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中；b.用常规的溴化氰方法活化琼脂糖填料；2)采用p-氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基将p-氨基苯甲脒和缩合剂1-乙基-3-碳二亚胺盐酸盐溶解在NaHCO3溶液中，然后与活化后的琼脂糖填料按体积比1∶10～1∶5混合，于室温下振荡偶联，使配基连接到琼脂糖填料上，反应结束后，将填料抽干，充分洗涤，再用Tris-HCl缓冲液和乙酸盐缓冲液交替洗涤2次以上，抽干，待用；3)用平衡缓冲液装柱，充分平衡；4)蚯蚓粗提物上样；5)非特异性洗脱采用平衡缓冲液，洗脱至基线；特异性洗脱是用包括0.01～3.0M的含有脲基或胍基化合物的平衡液作为特异性洗脱液，来进行特异性梯度洗脱；收集特异性梯度洗脱下来的单组分蚯蚓纤溶酶；6)除去洗脱下来的蛋白酶溶液中的盐；7)采用通常的工艺浓缩得到蚯蚓纤溶酶中的EFE-III组分。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，赫荣乔，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]