可提高联合固氮菌固氮水平的基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可提高联合固氮菌固氮水平的基因及其编码序列、该序列编码的多肽及该多肽在提高联合固氮菌固氮水平方面的应用。本发明专利技术克隆了含ｄｃｔ转运系统的ＤＮＡ片段并进行了序列分析；鉴定了植物因子诱导启动子；构建了重组联合固氮工程菌。本发明专利技术提供的ＤＮＡ片段所编码的多肽可用于生物固氮肥料的制备。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种可提高联合固氮菌固氮水平的基因及其编码序列、该序列编码的多肽，及该多肽在提高联合固氮菌固氮水平方面的应用。
技术介绍
生物固氮肥料，如联合固氮菌剂可改良土壤及提高产量。然而，直接分离自土壤的联合固氮野00110生菌株在自然条件下固氮效率和田间接种效果很不稳定，难以发挥联合固氮作用。在分子水平和基因水平上研究联合固氮作用的碳-氮代谢的遗传控制关系，解决或改善联合固氮的能量限制具有重要意义。联合固氮作用有三个重要的限制因子，即氧(失活)、铵(抑制)和能量(限制)。其中，能量限制是导致田间联合固氮效率低下最主要的因素，原因之一是生物固氮作用耗能大，每固定一分子的N2需消耗16个ATP；另一原因是在根表联合固氮菌的碳源供应十分有限。目前对控制四碳二羧酸运输的dct基因系统研究比较深入的是豌豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌。在根瘤菌中，编码C4-二羧酸运输系统的dct基因簇包括三个基因结构基因dctA(或dctP)，调节基因dctB和dctD。苜蓿根瘤菌的dctA基因前有一个NtrA依赖型启动子和一个上游元件。上游序列TGT-N10-GCA可能与NifA相互作用。dctA(或dctP)编码C4-二羧酸运输蛋白，有8个跨膜螺旋。dctBD编码的DctB和DctD属于NtrC家族的二元调控蛋白，可以对环境中的四碳二羧酸的浓度变化作出响应，激活dctA的转录。碳信号感应因子DctB既能自磷酸化(假定的磷酸化位点416位为组氨酸)，也能使DctD磷酸化。碳信号传递因子DctD的N末端(1-117)功能区与K.p的ntrC和E.coli的ntrC编码的蛋白同源，感应DctB传递的信号(Watson1990)。DctD的C末端(389-460)可以被磷酸化，可能是结合DNA的功能区，与RpoN(σ54)一起激活dctA(或dctP)表达(参见Scupham Aj.，Bosworth AH.Inoculation with Sinorhizobium melilotiRMBPC-2 increases A.Falfa yield compared with inoculation with a non-engineered wild typestrain.Appl.Environm.Microbiol.1996.624260-4262；Cooperative binding of DctD to thedctA upstream activation sequence of rhizobium meliloti is enhanced in a constitutively activetruncated mutant.J.Biological Chemistry.1996.27126435-26442；Mutational analysis ofthe phosphate-binding loop of rhizobium meliloti DctD，a σ54-dependent activator.J.Bacteriol.1998，1802792-2795)。在根瘤菌中，已证明dct基因簇编码四碳二羧酸转运过程中的关键酶系，转dctABD基因的工程苜蓿根瘤菌大大提高了四碳二羧酸类碳源如苹果酸、延胡索酸和丙酮酸等的利用率，在低碳条件下仍能保持高效的共生固氮效率。以上研究结果表明，克隆和鉴定联合固氮菌中与碳代谢基因dct同源的基因位点，研究其结构和功能，可在基因调控水平上揭示联合固氮菌碳-氮代谢遗传控制分子机制。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克隆含dct转运系统的DNA片段并进行序列分析；鉴定植物因子诱导启动子构建重组联合固氮工程菌。以下是本专利技术的技术方案一、含dct转运系统的DNA片段的克隆、1、土壤样品采集从生长野稗及芦苇的沼泽区自然环境中采集土壤样品。这些环境缺少联合固氮作用的三个重要限制因子氧(失活)、铵(抑制)和能量(限制)，土壤中富含与禾本科植物非共生联合固氮菌。2、分离群落水平总DNA采用免培养方法从土壤样品中分离群落水平总DNA。3、群落水平总DNA粘粒文库的构建用能够自主转移携带不同大小片段的粘粒pLA2917(四环素和卡那霉素抗性)作为载体，构建群落水平总DNA的粘粒文库。4、筛选含dct转运系统的阳性克隆根据苜蓿中华根瘤菌(Rhizobium meliloti)的dctA、dctB、dctD的序列设计引物，通过PCR法筛选粘粒文库，获得一插入片段为9.4kb的阳性克隆。二、所克隆dct转运系统的序列分析对阳性克隆插入片段的序列分析表明该片段为9408bp，其多核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，共有8个开放阅读框(open reading frame，ORF)，在大片段中的位置及物理图谱见图1，各ORF编码及功能见表1。其中ORF dctB、dctD、dctP、dctQ、dctM为四碳二羧酸的转运过程中的关键酶系，它们编码的蛋白序列如SEQ ID NO2～6所示。表1 各ORF编码产物及功能ORF 编码产物功能rmlA 葡萄糖-1-磷酸胸苷酸转移酶脱氧二磷酸胸腺嘧啶-4-脱氢鼠李糖3，5-差rmlC 向异构酶rmlD 脱氧二磷酸胸腺嘧啶-4-脱氢鼠李糖还原酶dctB 四碳二羧酸运输感受蛋白 调控基因，组成一个二元调控系统，保持低水平的组成型表dctD 四碳二羧酸运输反应调节蛋白 达。dctP 可能为四碳二羧酸结合蛋白 结构基因dctQ 可能为四碳二羧酸转运酶 编码四碳二羧酸转运酶dctM 可能为四碳二羧酸转运酶 编码四碳二羧酸转运酶三 植物因子诱导启动子的鉴定通过PCR扩增dctP基因的启动子序列(如SEQ ID NO7所示)，XhoI酶切连入载体pVK100(Tc抗性、Km抗性)中并在其后连入lacZ基因，筛选具有唯一Tc抗性的转化子。通过接合实验转入Pseudomonas stutzeri A15中，Tc抗性筛选重组菌。重组菌在加入延胡索酸、苹果酸、琥珀酸等四碳二羧酸的培养基中，lacZ表达，菌落表现为蓝斑，说明该启动子为植物因子诱导表达启动子。四 联合固氮工程菌的构建将含dctPQM基因簇的xhoI酶切片段连入穿梭载体pSZ21中构建重组质粒pSZ24，转化E.Coli DH5α，再通过三亲接合在帮助质粒pRK2013的帮助下转入Pseudomonasstutzeri A15中，通过卡那抗性筛选得到将dct基因簇整合入Pseudomonas stutzeri A15染色体的重组菌。质粒构建如图2所示。工程菌大田释放表明重组菌能提高大田水稻产量，在土壤氮和有机质含量低的田块中，接种重组菌株的水稻产量比接种野生型高15.9％，比无菌对照提高20.9％。本专利技术提供的可提高联合固氮菌固氮水平的基因簇和编码序列具有如下特性1)提高联合固氮菌的碳代谢，从而提高固氮水平的功能明确；2)其启动子具有植物因子诱导表达的固氮调节基因的特性；3)所涉及的与四碳二羧酸转运的dctBDP基因簇为新基因，可用于构建联合固氮工程菌。附图说明图1是dct基因排列及物理图谱图2是广寄主范围转移重组质粒pSZ24的构建其中Cm氯霉素抗性；Nm；卡那霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示序列的ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：林敏，闫春玲，平淑珍，徐玉泉，
申请(专利权)人：中国农业科学院原子能利用研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]