植物基因组的修饰制造技术

本发明专利技术涉及转化植物细胞和修饰植物基因组的领域。本发明专利技术提供了一种转化植物细胞的方法，包含为所述的细胞提供位点特异性的重组酶活性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及对植物细胞进行转化和植物基因组修饰的领域。当前的植物转化技术普遍依赖抗生素或除莠剂抗性基因为转化的细胞提供其在选择试剂中的选择性生长优势，从而允许转基因组织的产生。转化通常被看作细胞/组织/植物获得由一种核酸分子所编码的性质的过程，该核酸分子是通过，但不限于，显微注射、提高细胞膜的通透率、微粒导入(biolistics)或根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)感染的方法被引入细胞内。该新引入的核酸不仅包含一段编码表现所需获得性性质的蛋白质的编码区域，还包含附加的调控序列如启动子，即一种核苷酸序列，通常位于编码区域上游(5’)，通过提供对RNA聚合酶和/或在正确位置上起始转录所需的因子的识别而控制该编码区的表达；一种聚腺苷酸化信号或终止子，其为一种核苷酸序列，通常位于编码区下游(3’)，控制多聚腺苷酸的增加以及转录的终止，或者是一种控制转录起始、延长和终止的调控性核苷酸序列。存在于转化后的植物中的标记物或其残留物通常是不受欢迎的。从另一个角度来说，消除使用的标记物是非常必要的，因为转基因植物中存在的特定标记性基因阻碍了在随后对该植物的修饰过程中使用相同的标记基因。理论上，使用多个所需基因联合转化某种植物可以解决这个问题，该方法需要对未来市场进行准确的预测。然而，可以想象，技术人员希望以后能够将附加的性状引入已经成功的转基因的农作物中。不过，可供选择的标记物是有限的。使用来自噬菌体P1中的位置特异性重组Cre/lox系统切除一段(标记物)基因是有关标记物去除系统的最早报告的例子之一(Odell等，1990；Dale和Ow 1991；Srivastava等，1999)。在该系统中，当lox重组位点以同一方向位于标记物的两侧翼时，通过Cre重组酶的作用可精确而保守地切除该标记物和该侧翼重组位点中的一个。该方法一大的缺点是需要额外将重组酶引入该转基因植物中以除去一段(标记物)基因。这就导致了必须以包含重组酶基因的构建体利用对第二种标记物的选择进行第二次转化，或者具有目标标记物的第一轮转化后得到的转基因植物，必须与包含该重组酶基因的转基因植物发生杂交。即使取得成功，该转化或杂交产生的后代仍然需要自体授粉或与一株非转化的植物杂交，以分离两种独立的转基因基因座，并找出只包含具有所需转基因的修饰后的T-DNA的植物。另外一种方法涉及转座介导的重新定位(re-positioning)以及随后自转基因番茄中消除标记物基因(Goldsbrough等，1993)。在该系统中，Ds元件位于其侧翼的标记物被顺式(in cis)提供的Ac转座酶从所需的转化基因中分离出来。如果转座产生的第一次和第二次的插入位点之间的基因距离足够，二者间的重组通过自交和远交可能产生出不含有标记物的后代。因此，这两种方法似乎都不适合无性繁殖的农作物，因为必要的有性杂交会导致基因组的混杂(Flavell等，1992)。然而，在第二种方法中，不进行杂交分离标记物和目的基因也是可能的，因为Ds有时候不会再整合，但这只占转座事件的10％。Ebinuma等(1996；1997a)在一种双功能标记物方法中使用了ipt基因，最先表明标记物可由位点特异地重组系统被去除，而不必依靠杂交、双重转化或流产转座事件(abortive transposition event)。在其多个自动转化(Multi-Auto-Transformation(MAT))方法的第一阶段，外植体上生成的转化枝条可通过其矮小的表型与未发生转化的枝条区分，该表型是由于位于T-DNA上的ipt基因过度表达产生过量的细胞因子引起的。由于枝条再生培养基中细胞因子的缺乏，未经转化的细胞的再生减少，至少在那些其再生需要该激素的种类中如此。转移至新鲜的培养基后，正常的枝条通过重组酶活性丢失其标记物后，从这些茂密的枝条中显现出来。值得注意的是，R重组酶基因和标记物都位于同一T-DNA上，该重组酶基因的产物去除标记物和重组酶，使该系统可被反复利用。较早的在植物中应用这些系统的报告一直是在转化的第二个阶段或通过杂交而单独并以反式提供重组酶(见上文)。Ebinuma等(1996)采用的方法与其他方法的另一不同之处在于其也将ipt基因作为阴性选择的标记物。标记物的丢失使正常生长的枝条可以从周围其他的枝条中被区分出来。最早的以SR1重组酶为特征的MAT系统中，其活性为组成型表达，但明显地，其活性几乎不能达到足以去除重组位点侧翼内的目标的水平。在最近的关于MAT系统的描述中，R重组酶上游的CaMV 35S启动子被除草剂安全剂诱导型GST-II-27启动子替代，导致ipt选择性枝条外植体的频率增加(Sugita等，2000)。但矛盾的是，上述方法的成功依赖于低重组酶活性。Gleave等(1999)描述了另一种生成不含标记物的植物的方法，该方法不需要杂交或自交。在该方法中，植物首先经一种构建体进行转化，该构建体中待去除的DNA片段的侧翼为lox重组酶位点。随后，两种单拷贝的转化子由含有携带Cre重组酶的构建体的土壤杆菌进行转化。然而，该构建体并非是要得到稳定的整合，而是应该瞬时产生足够的重组酶活性以引起位点特异性重组。因此，并未使用双态质粒中的hpt标记物，并从再生培养基中去除潮霉素。由于以lox作为侧翼的DNA片段包括胞嘧啶脱氨酶基因，通过氟胞嘧啶耐受性(FC；Stougaard，1993)即可评价去除情况。结果表明，对经重组酶介导的去除进行测验的枝条中仅有0.25％耐受FC；其中大部分是由整合的Cre重组酶所引起的。并非所有的标记物去除系统都需要辅助蛋白如重组酶来诱导去除事件。Zubko等(2000)报告在噬菌体λ中的attp区域之间进行染色体内重组可产生不含标记基因的转基因烟草。然而，该切除的精确度和频率都是低的。本专利技术提供了一种特征在于去除标记物基因的转化系统，其对于植物生物技术总体上来说是极其重要的，因为其可以降低对其他标记物的需要，这些标记物每种都各有特性，并且须经特定的改变以适应转化的需要。本专利技术还提供了一种获得基本上不含有标记物的转化的植物细胞、植物或其部分(如根、枝条、分生组织、或胼胝物质)及其后代的方法，并提供了所述的基本上不含标记物的转化的植物或其部分。在本专利技术提供的一种优选的方法中，重组酶的活性受到严格控制，而且诱导很快引起立即去除(所有)插入的选择性标记物和重组酶基因的高活性，而过去诱导重组酶活性的尝试则不具有这些优势。例如，在WO0136595中，重组酶的活性不受配体结合域(LBD)调控(更不可能是翻译上的融合)，也进行阴性选择来获得不含有标记物的植物或植物细胞。此外，在Lyznik等(Plant Journal 8177-186，1995)等的文章中，不恰当地使用了FLP重组酶，并且是该FLP基因的一种野生型而不是适合植物的类型。重组酶的活性也不受(翻译融合)配体结合域的调控，因此基本上没有进行阴性选择以获得不含标记物的植物(细胞)，而且重组酶的基因也未随标记物基因一起被去除。在Sugita Koichi(Plant Journal 22461-469，2000)等人的文章中，重组酶活性被化学诱导的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转化植物细胞的方法，包含为所述的细胞提供诱导型位点特异性重组酶活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：赫拉德约翰阿道夫鲁文达尔，
申请(专利权)人：植物研究国际公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]