在酵母菌中高效生产异源性蛋白质的方法和组合物技术

本发明专利技术提供的方法和组合物克服了以前这些蛋白质不能恰当折叠的问题，因而能在酵母菌和其他真菌中高效生产异源性蛋白质。按照本发明专利技术，真菌所使用的质量控制机制将错误折叠的蛋白质送回胞质，操纵其降解从而分泌这些蛋白质。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总体上涉及分子生物学领域。更具体说，本专利技术涉及在酵母菌和其他真菌中通过操纵内质网的蛋白质加工，来高效生产异源性蛋白质的新方法。本专利技术的方法可用于大规模生产异源性蛋白质并且包括这种生产所需的方法和新式载体。
技术介绍
基因操纵技术的发展使得用微生物大量生产有用的蛋白质成为可能。原核细胞如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌因它们的遗传学特征已熟知而被广泛用作宿主。然而，具有药物价值的大多数生物分子是真核细胞分泌的蛋白质，当它们在原核细胞中产生时常常失去功能。以产业化规模生产需要的真核细胞蛋白质，如激素、抗体、凝血因子、蛋白酶、各种酶、生长因子和抑制剂以及疫苗用的病原分子，一直是一个难题。理论上可采用发酵使微生物无限制繁殖来生产这些分子，然而细菌等的表达系统缺乏真核细胞使用的分泌装置，故不能完完全全地合成这类蛋白质。作为单细胞真核生物，酵母菌似乎对解决此难题有相当前景，因为酵母菌具有所有真核生物共同的正规分泌通路。但酵母生产方法只获得有限的成功，因为大多数异源性蛋白质产生在错误的部位或不能恰当地折叠。有助于分泌性蛋白质适当定位的一种方法，是融合一段内源性信号序列以指导异源蛋白质运输到内质网中，这是分泌通路的第一步。这有助于解决定位问题，但发现大多数异源蛋白质即使在内源信号序列帮助下被恰当地转运到内质网腔室(compartment)中仍不能折叠。在这种情况下，采用哺乳动物组织培养来合成蛋白质成为唯一实用选择。不幸的是，需要的生长培养基和设备使此方法费用高昂、选择复杂。酵母菌是高度安全的，因为已长期使用酿酒酵母菌生产发酵产品，如酒制品或面包。酵母菌通常以高于细菌的细胞密度被培养并且可连续培养。在分泌的蛋白输出到培养基中时，酵母菌还可提供其糖基化，从而保存了其活性需要这种修饰的蛋白质的活性。然而，仍然需要解决的是，其他生物的许多分泌性蛋白在酵母菌中生产时为何不能产生活性蛋白？以及为什么酵母菌对这些类型的蛋白质仍然是一种不稳定的表达系统？从以上所述可以明白，本领域仍然需要开发有效、方便和高效率的转化系统，以获取在酵母菌中生产的优点但没有蛋白质错误折叠问题。本专利技术的一个目的是提供能完成上述需要的酵母菌转化方法。本专利技术的另一目的是提供将用于细菌的转基因技术应用于生产商品化异源蛋白质的机制。本专利技术还有一个目的是提供用于此种转基因方法的聚核苷酸构建物(constructs)、载体、转化的细胞。本专利技术的其他目的通过以下对本专利技术的描述将变得清晰。
技术实现思路
本专利技术的方法能够对酵母菌进行基因修饰，促进其作为生物发酵器的用途，以大规模生产重要的商品化蛋白质产品，如人生长激素。本专利技术促进了异源性分泌蛋白在酵母菌中的恰当合成，克服了先前酵母表达系统不能折叠许多异源性蛋白质的问题。此外，本专利技术提高了已获得的某些成功的酵母表达蛋白质的产量和活性。简言之，本专利技术使得酵母产生的异源性蛋白质更类似于(如果不是相同于)原先宿主生物所合成的蛋白质。可以采用本专利技术的转化方法与本领域已知的常规应用于细菌、植物和动物的遗传工程技术，一起来从遗传上操纵酵母菌生产，收获重组蛋白质。根据本专利技术，操纵酵母菌的质量控制机制，使错误折叠的蛋白质返回胞质溶胶，操纵其降解从而分泌这些蛋白质。本专利技术一优选实施例包括利用受到操纵的受体酵母细胞，以抑制与O-糖基化相关的酶或Bypass of Sec Thirteen家族。作为质量控制的一部分，要消除对蛋白质的酵母菌的特异性修饰。抑制O-糖基化可防止不适当的酵母菌特异性修饰从而避开了酵母菌的质量控制机制。可用本专利技术的任何方法来产生本专利技术的受体宿主细胞，包括缺失突变、反义序列或者甚至给予参与这些酶家族调节通路的酶的外源性激动剂或拮抗剂。本专利技术还包括含有分离自这种转基因酵母菌的蛋白产物的新颖组合物。还包括用于该程序和转化细胞、载体和掺入了它们的转基因酵母细胞。在一优选实施例中，设计了一种新的载体，可帮助提高转基因蛋白质在酵母菌中的产量。定义以上所用的以及整个说明书和权利要求书所用的与本专利技术组合物和方法有关的各种术语，除另有说明，都具有这里所说明的含义。各种单位、前缀和符号可以它们的SI形式表示。除非另有说明，分别为核酸序列书写从左到右为5’-3’方向，氨基酸序列书写从左到右为氨基末端——羧基末端方向。数字范围包括确定范围的编号和确定范围中的各个整数。氨基酸可用其通常知道的三字码表示或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字码表示。同样核苷酸可用它们通常接受的单字码表示。除非另有说明，本文所用的软件、电气或电子学术语如“新的IEEE电气和电子学术语标准词典”所定义的那样(1993第5版)。以下的术语参见本说明书后对整个含义的理解会更加完全。“反义寡核苷酸”是一种至少6个连续核苷酸的、最好与DNA互补(反基因)或RNA互补(反义)的分子，能干扰内源蛋白质的转录或翻译过程，以抑制基因产物的产生。“克隆载体”是一种DNA分子，例如质粒、粘粒或细菌噬菌体，能在宿主细胞中自主复制。克隆载体一般含有一个或多个限制性内切酶识别位点，外源性DNA序列可以限定方式插入此位点而不会丧失载体的基本生物学功能，此位点也可插入适当的标志基因，用于鉴定和选择受此克隆载体转化的细胞。标志基因一般包括提供对抗菌素如潮霉素、四环素或氨苄青霉素等的抗性的基因。“编码序列”或“编码区”指一种核酸分子，其含有必须的序列信息，当此序列表达时可产生一基因产物。术语“保守性修饰变异体”用于氨基酸和核酸序列两者。对于具体的核酸序列，保守性修饰变异体指编码相同氨基酸序列的或编码氨基酸序列保守性修饰变异体的那些核酸。由于遗传密码子的简并性，许多功能相同的核酸可能编码任一给定的蛋白质。例如密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此在一密码子编码的丙氨酸的每一位点，该密码子可以改变为上述相应密码子之一，而不会改变所编码的多肽。这类核苷酸变异是“沉默变异”，代表一种保守性修饰变异。本文中编码一条多肽的每条核酸序列也称为遗传密码，描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。普通技术人员懂得，可对核酸中的每个密码子(除AUG和UGG外，AUG是甲硫氨酸的唯一密码子，UGG是色氨酸的唯一密码子)进行修饰以产生功能相同的分子。因此编码本专利技术多肽的核酸的每个沉默变异都包含在各个描述的多肽序列中并在本专利技术范围内。对于氨基酸序列，技术人员懂得对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各种取代、缺失或添加、改变、以增加或缺失了该编码序列中的一个氨基酸或一小部分氨基酸，是一种“保守性修饰变异”，其中这种改变导致一个氨基酸被一个化学性质上类似的氨基酸所取代。如此，可改变选自包括1至15之间整数的氨基酸残基的任何数目。例如，可进行1、2、3、4、5、7或10个残基改变。保守性修饰变异体通常提供类似于衍生该变异序列的未修饰多肽序列的生物活性。例如，对其天然底物来说，底物特异性、酶活性或配体/受体结合一般至少为天然蛋白质的30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的活性。本领域熟知能提供功能相似氨基酸的保守性取代的名单。以下6组各含有互相可保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)； 4)精氨酸(R)、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在真菌中生产异源性蛋白质的方法，其特征在于，此方法包括提供一种受体真菌细胞，和向所述受体真菌细胞导入一聚核苷酸表达构建物；所述细胞中的质量控制机制经修饰以致折叠不完全的异源性蛋白质在内质网中不会被降解。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：戴维斯TW吴，希尔帕瓦什斯特，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州立研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]