用于核移植的卵的制备方法及其用途技术

一种通过将卵暴露于γ射线照射下而将卵去核的方法。使用的γ射线照射剂量要足够高以便终止被照射卵的细胞核所指导的卵或由其产生的胚胎的发育，而且还要足够低以便使得转移到该去核的卵中的细胞核能指导卵或胚胎的发育。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种将卵去核的方法，特别是将用作核移植技术中的受体细胞的卵去核的方法。
技术介绍
利用核移植(nuclear transfer)方式进行胚胎克隆的第一个实例在1952年完成(Briggs和King，Proc.Natl.Acad.，Sci.USA 38 455-461(1952))。之后，已经在多个物种中实施了核移植，“Dolly”绵羊的出世使之达到了顶峰(Campbell等，1996，自然380 64-66)。通过将一个供体核移植到一个去核的卵母细胞或单细胞受精卵所进行的胚胎重建可以生成遗传学相同的个体。这对于研究(换而言之，作为生物学对照)以及在商业应用上(也就是，繁殖遗传学优势的家畜及肉制品的均一性)都有着显著的优点。核移植也形成了发展遗传学修饰家畜品种的有效方法的基础。如果供体细胞已经被遗传学修饰，那么在核移植后发育成的动物就包含有这种遗传学修饰(McCreath KJ，HowcroftJ，Campbell KH，Colman A，Schnieke AE，Kind AJ.(2000)自然4051004-1005)。核移植(nuclear transfer或nuclear transplantation)技术包括将来自一个细胞的完整的细胞核转移到另一个已经去除或破坏了细胞核DNA的细胞中。特别的，这个过程包括将供体细胞核引入到受体卵或卵母细胞的细胞浆中，因此该受体卵或卵母细胞从供体细胞核中获得了遗传物质并具有了发育成一个胚胎的能力，这个胚胎将发育成能存活的成年动物。为了利用核移植技术成功地生成一个动物个体，将供体细胞的细胞核转移到一个去核的受体卵中是必要的。所有两栖动物、哺乳动物和鱼类的成功的核移植方法都要求在引入供体细胞核之前将受体卵去核，该供体细胞核取代受体卵的细胞核并指导发育。去核包括将受体卵的细胞核去除或失活。受体卵可以是未受精的卵或刚受精的受精卵阶段的卵。如果卵还没有受精，它将含有雌性前核(pronucleus)，后者必须被去除或失活。如果该卵已经受精，它将含有雌性前核和受精后来自精子的一个雄性前核或多个雄性前核。在用供体细胞核取代之前，每个前核都必须被去除或失活。因此受体卵的去核是核移植方法中一个主要的限制步骤。至今，多种方法已经被应用。在诸如蟾蜍的两栖动物中，通常利用紫外线照射方法进行去核，该方法通过破坏DNA将细胞核失活(Gurdon，1986 J.Cell.Sci.Suppl.4287-318)。另一种已经应用于诸如豹蛙(leopard frog)卵的两栖动物卵的去核方法是用针头人工操作去核。在哺乳动物中，通常利用微吸管物理去除卵细胞的细胞核而进行去核(见例如，Campbell等，1996，自然380 64-66；Wakayama等，1998，369-374)。在鱼类中，物理去核已经被用于制备用于斑马鱼核移植的受体卵(Lee等，自然生物技术，2002，8月；20(8)795-9)。利用X射线对未受精的鳉鱼(medaka fish)卵母细胞进行的去核已经被报道(Wakayama等，PNAS(2001)98，1071-1076)。然而，尽管在许多物种中已经获得了成功的去核，但在已知的方法中始终存在着问题。例如，物理去核对技术有着很高的要求且成功率低；紫外线照射伴有热的产生，这可能对细胞造成不可接受的损伤；而X射线去核要求高剂量的X射线，这同样可以对细胞造成不可接受的损伤。因此，去核步骤仍然是核移植实验中的一个主要限制步骤并且可能是非常难以完成的。这个问题对于禽类细胞是特别重要，这是因为禽类的卵的独特结构，它是特别难以进行成功的去核。雌性前核位于胚盘，胚盘为卵黄表面的一个直径为近乎2毫米的白点。禽类的卵包括大量的卵黄，比较于其他动物的卵，它非常大并且易碎。因此对它不能象对两栖动物、哺乳动物或鱼的卵那样轻易地进行操作。当尝试用物理去核方法时，发现了一些问题比如禽类的卵中的前核不容易看到并因此很难被人工操作去除。对禽类的卵进行紫外线照射同样是不令人满意的。对应用紫外线照射雌禽的卵的评估显示终止受精卵发育所需的紫外线剂量产生了如此多的热量以致损坏了卵。X射线是不适用的，因为所需的高剂量和照射持续时间可能对细胞造成不可接受的损伤。因此，可以看到提供另一种有效的去核方法是有意义的，尤其是一种能用于有效地对禽类的卵进行去核的方法。本专利技术的进一步的目的是提供了一种将卵去核的方法，这种方法不会对卵造成令它们不能再被用于核移植方法的损伤。本专利技术的仍进一步的目的是提供一种简单和快速的去核方法。
技术实现思路
本专利技术人已经惊奇地发现γ射线可以用于有效地将卵去核，特别是禽类的卵，因此由被照射卵的细胞核所指导的发育将停止，但是转移到被照射卵的供体细胞核所指导的发育可以继续。根据本专利技术的第一方面，提供了一种通过将卵暴露于γ射线照射以将卵去核的方法。优选地，使用的γ射线的剂量要足够高，以便能有效地终止被照射卵的细胞核所指导的卵或由其产生的胚胎的发育，但也要足够低，以便使得转移到该去核卵的细胞核能指导卵或胚胎的发育。因此，该剂量使得被照射细胞核不能指导任何的发育。因此，由被照射卵的细胞核在照射之前所指导的任何发育将被终止且由该被照射卵的细胞核所指导的任何发育将被阻止。任何随后的发育均由转移到去核卵中的细胞核所指导。本专利技术的方法可以用于任何动物的卵，例如，哺乳动物、两栖动物、禽类、爬行动物或昆虫的卵。在优选的实施方案中，卵为禽类的卵。在本专利技术的方法中所使用的卵可以是未受精的卵或刚受精的受精卵阶段的卵。将卵暴露于γ射线的时间可以长到能给予有效的照射以终止被照射卵的细胞核所指导的发育，及短到使得该卵能用于作为核移植技术的受体卵。如果卵没有受精，所用剂量将能有效地终止同等的受精卵的发育。例如，所用剂量应当是足够短，以使得转移到卵的供体细胞核能指导该卵或来源于该卵的胚胎的发育。暴露于照射的时间、每分钟的剂量和应用于卵的总剂量依赖于许多因素，例如卵的大小和类型。在本专利技术优选的实施方案中，卵暴露于γ射线的时间在1分钟到10分钟的范围内，例如，2到5分钟，优选的为2到4分钟。在本专利技术另一个优选的实施方案中，卵暴露于γ射线的时间为1到3分钟的范围。优选地，每分钟的照射剂量范围为每分钟2到25Gy的照射剂量，例如，每分钟2到20、2到15、2到12、2到10、2到8、2到6、5到25、10到25、15到25、5到10、5到15或10到15Gy。在一个优选的实施方案中，将卵暴露于每分钟15Gy到每分钟25Gy的照射剂量，例如每分钟18.6Gy的照射剂量。在这个实施方案中，优选地，利用爱丁堡大学细胞、动物和群体生物学研究所的RX20/53M辐射器测定照射剂量。在另一个优选的实施方案中，将卵暴露于每分钟2Gy到每分钟12Gy的照射剂量。使用的γ射线照射的总剂量优选的为大于7Gy，例如，大于8Gy，优选的大于9Gy，更优选的大于10Gy，还更优选的大于11Gy，最优选的大于12Gy。在特别优选的实施方案中，照射的总剂量为12和14Gy之间，例如12.8Gy。优选的，将卵暴露于10和62.5Gy之间的总照射剂量，例如，10和50、10和40、10和30、20和62.5、20和50、20和40、20和30、30和62.5、3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将卵去核的方法，其中将卵暴露于γ射线照射下。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：海伦桑，艾德里安舍曼，
申请(专利权)人：维尔基公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]