本发明专利技术提供一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，它将大规模培养出来的病毒液经过１．０－０．６μｍ、０．６－０．４５μｍ、０．４５－０．２２μｍ孔径的三级滤柱过滤、澄清，超滤浓缩，柱层析纯化及灭活等后处理工艺，将病毒液制备成纯度高、免疫原性及安全好、质量稳定的合格疫苗半成品，从而满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需要。本发明专利技术可大规模处理大量的病毒液，且生产工艺稳定，重复性好；用本发明专利技术生产的疫苗半成品，无外原因子污染，细胞ＤＮＡ残留量少，灭活后的半成品经检查无活病毒存在，安全可靠，半成品抗原含量高，能够满足成品生产的需要；用本发明专利技术生产的疫苗半成品制备成Ｓａｂｉｎ ＩＰＶ成品疫苗，其质量稳定，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的后处理方法，属于医学生物
技术介绍
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒I、II、III型引起的传播广泛且危害极大的急性传染病。临床症状引起肌肉特别是肢体松弛性麻痹，多发生于小儿，因此又称为“小儿麻痹症”。在疫苗问世前，该病在全世界范围内流行，当时我国的发病率为3.18/10万。50年代中后期，美国的两位科学家Dr.Salk和Dr.Sabin先后成功研制出脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)，从而为人类预防和消灭脊髓灰质炎提供了有力武器。实践证明这两种疫苗都是安全有效的。我国从1960年开始生产OPV供全国儿童服用。到目前为止总计供应了40多亿人份的三价OPV，取得了辉煌的成绩。然而，早期制造的IPV由于受到生产工艺的限制，抗原含量低，免疫效果不理想，尤其是随着全世界消灭脊髓灰质炎进程的推进，与OPV相关的病例(VAPP)和由疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(VDPV)而引起的病例正受到人们的关注，如2000年在多美尼加和海地，2001年在菲律宾以及2002年在马达加斯加发生的疫苗衍生株引起的麻痺病例，此外疫苗病毒毒株在免疫缺陷的人体内可长期存在，。为此，一些发达国家开始改变疫苗使用方案，采取先用IPV再用OPV的方案，进而过渡到仅使用IPV的方案，因为只有使用IPV才能避免疫苗相关病例的发生。但采用常规的方法，既不能满足大规模生产的需要，也不能处理大规模生产的病毒液，因此，有必要对现有技术加以改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能处理大规模生产的病毒液，制备出高质量的疫苗，满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗生产需要的方法。本专利技术通过下列技术方案实现一种，其特征在于采用下列工艺步骤 1、澄清将大规模培养出来的病毒液经过1.0-0.6μm、0.6-0.45μm、0.45-0.22μm孔径的三级滤柱过滤、澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；2、浓缩将澄清过的病毒液，用10万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩200～400倍。3、纯化a、凝胶过滤浓缩的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液；B、离子交换凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化，即用80mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液pH7.0-7.2，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰即为纯化的病毒液；4、除菌过滤纯化的病毒液用0.22μm的滤膜除菌过滤，之后加入10倍浓缩M199，使病毒液中含有原倍的M199；5、灭活在过滤的病毒液中，按终浓度为1/4000加入福尔马林灭活剂，在35-37℃温度下灭活12-14天，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌瓶中，继续灭活至12-14天，转入4℃保存，即为单价半成品。病毒液在经过步骤3的纯化后，去除了细胞DNA及杂蛋白，使纯度达到要求。本专利技术具有以下优点1、可大规模处理大量的病毒液，能够满足减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗的生产需求，且生产工艺稳定，重复性好(结果见表1、表2)。2、用本专利技术生产的疫苗半成品，无外原因子污染，细胞DNA残留量少，灭活后的半成品经检查无活病毒存在，安全性好，半成品抗原含量高，能够满足成品生产的需要(结果见表3)。3、用本专利技术生产的疫苗半成品制备的Sabin IPV成品疫苗，质量稳定可靠，安全性及免疫原性良好，经检定全部符合国家生物制品规程的要求(结果见表4)。4、用本专利技术生产病毒液制备的疫苗，经25℃和37℃放置两周，以及4℃长期存放后，检测疫苗热稳定性，结果表明该疫苗稳定性良好，其有效期可达两年以上(结果见表5及表6)。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进一步描述。实施例11、澄清将550升发酵罐培养的病毒液350升，经孔径为0.75μm、0.45μm、0.22μm的三级滤柱过滤澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；2、浓缩将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中，用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升；3、纯化A、凝胶过滤在Phamacia Index70层析柱中，装Sepharose CL-6B层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平，取病毒浓缩液，加入层析柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰(病毒峰)约600毫升；B、离子交换在Phamacia Index100层析柱中，装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平，将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集出现的洗脱峰约800毫升，即为纯化的病毒液，层析柱用1mol/L NaCl洗脱，之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用；4、除菌过滤先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗，滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中，再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中，之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜，并将滤液同样收集到上述瓶中；5、灭活在过滤的病毒液900毫升中，加入10％福尔马林2.25毫升，使福尔马林终浓度为1/4000，放入37℃孵箱中灭活，每天取样观察，灭活至第6天时，将病毒液用0.22μm滤膜过滤至另一无菌已硅化1000毫升瓶中，继续灭活至12天，转入4℃保存，即为单价半成品。实施例21、澄清将550升发酵罐培养的病毒液350升，经孔径为1.0μm、0.6μm、0.45μm的三级滤柱过滤澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保持病毒液的无菌状态；2、浓缩将澄清的病毒液在Millipore交叉流超滤设备中，用10万截留分子量的超滤膜浓缩至1.4升；3、纯化A、凝胶过滤在Phamacia Index70层析柱中，装Sepharose CL-6B层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平，取病毒浓缩液，加入层析柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集第一峰(病毒峰)约600毫升；B、离子交换在Phamacia Index100层析柱中，装入DEAE SephasoreFast Flow层析填料，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲平，将凝胶过滤收集的600毫升病毒液加入柱中，用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱，紫外吸收波长280测吸收值，收集出现的洗脱峰约800毫升，即为纯化的病毒液，层析柱用1mol/L NaCl洗脱，之后用80mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)冲平备用；4、除菌过滤先将0.22μm的滤膜用50毫升10倍浓缩M199冲洗，滤液收集至一硅化的无菌1000毫升瓶中，再将离子交换收集的800毫升病毒液过滤到此瓶中，之后用40毫升10倍浓缩的M199及10毫升注射水洗膜，并将滤液同样收集到上述瓶中；5、灭活在过滤的病毒液900毫升中，加入10％福尔马林2.25毫升，使福尔马林终浓度为1/4000本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗后处理方法，其特征在于采用下列工艺步骤：１）、澄清：将大规模培养出来的病毒液经过１．０－０．６μｍ、０．６－０．４５μｍ、０．４５－０．２２μｍ孔径的三级滤柱过滤、澄清，去除病毒液中的细胞碎片及杂质，并保 持病毒液的无菌状态；２）、浓缩：将澄清过的病毒液，用１０万截留分子量的超滤膜将病毒液浓缩２００～４００倍。３）、纯化：ａ、凝胶过滤：浓缩的病毒液用层析柱纯化，即用８０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液ｐＨ７．０－７ ．２，紫外吸收波长２８０测吸收值，收集第一峰即为凝胶过滤纯化的病毒液；Ｂ、离子交换：凝胶过滤纯化的病毒液用层析柱纯化，即用８０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液ｐＨ７．０－７．２，紫外吸收波长２８０测吸收值，收集第一峰即为纯化的病 毒液；４）、除菌过滤：纯化的病毒液用０．２２μｍ的滤膜除菌过滤，之后加入１０倍浓缩Ｍ１９９，使病毒液中含有原倍的Ｍ１９９；５）、灭活：在过滤的病毒液中，按终浓度为１／４０００加入福尔马林灭活剂，在３５－３７℃温度下灭活１２－ １４天，每天取样观察，灭活至第６天时，将病毒液用０．２２μｍ滤膜过滤至另一无菌瓶中，继续灭活至１２－１４天，转入４℃保存，即为单价半成品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：褚嘉祐，姜述德，孙明波，廖国阳，张丽旌，李卫东，俞泳霆，李平忠，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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