拟南芥属(Arabidopsis)用于生产人类及动物的治疗及诊断用蛋白质的商业用途制造技术

本发明专利技术提供利用拟南芥属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）的多种生长参数，使于经过控制的室内环境下生长致密植物族群，用以收获生物物质及分离蛋白质，特别是适合供医药用途的重组蛋白质。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用鼠耳芥大量制造蛋白质。
技术介绍
大量制造蛋白质为有效探勘人类使用的重组基因产物例如治疗性蛋白质所需。虽然微生物系统经常就转殖以及制造转化细胞速度上提供明白优势，但由实验室规模扩大至大型发酵容器的规模扩增上经常有困难。由于细菌与真核生物间的多种翻译后处理步骤不同，故有某些蛋白质无法于原核生物系统制造。哺乳类及昆虫细胞培养广泛用于制造多种蛋白质及最显著的优势可能是翻译后处理。但培养基、设备以及培养条件苛刻的趋势制造成本增高，显然为此种系统的劣势所在。此种系统的另一项缺点为可能携带有对人类健康构成威胁的病毒粒子或朊病毒。也曾经描述转基因动物于乳汁、排泄于尿液、或透过鸟类的卵以制造用来制造人类蛋白质。类似动物细胞培养，转基因动物须提供具有所需翻译后修饰的蛋白质。但转基因动物的制造缓慢、维持困难、不容易大规模养育。制造成本相当高以及同样的纯化问题构成此种系统的问题。使用植物作为重组蛋白质表达系统或「生物反应器」是在基于细菌、酵母菌、昆虫、动物及细胞制造系统以外的具有吸引力的替代的系统。植物制造蛋白质有多种好处，使用植物于制造转基因蛋白质正获得广泛证实。植物制造系统容易纯化，不含动物病原性污染物。对大量植物种属存在有转化方法。当使用多种种子植物及农作物时，对于收获以及处理大量材料已经存在有方法及基础架构。将规模放大相当直接，只要单纯基于扩大制造种子以及栽种面积即可。如此生产成本减低，哺乳动物的病毒或者朊病毒污染风险下降，原料及制造设备成本比透过哺乳动物细胞培养或转基因动物来制造类似材料的设备投资需求相对较低。植物通常只有单一显著缺点，该缺点系在翻译后蛋白质的糖基化作用。但于许多案例已经验证植物的替代碳水化合物修改不会对糖蛋白造成有害影响或非期望的免疫原性质。已经发展出多种制造系统用以于植物中表达的蛋白质。包括于油体表达的蛋白质(Rooijen等人，109植物生理学1353-61(1995)；Liu等人，3分子育种463-70(1997))透过根瘤菌表达的蛋白质(Borisjuk等人，17自然生物技术466-69(1999))于种子表达的蛋白质(Hood等人，3分子育种291-306(1997)；Hood等人，透过高等植物生物工程的化学品(编辑Shahidi等人)普雷能(Plenum)出版公司，127-148(1999)；Kusnadi等人，56生物技术及生物工程473-84(1997)；Kusnadi等人，60生物技术及生物工程44-52(1998)；Kusnadi等人，14生物技术进展149-55(1998)；Witcher等人，4分子育种301-12(1998))，于病毒表面的抗原决定簇(Verch等人，220免疫方法期刊69-75(1998)；Brennan等人，73病毒学期刊930-38(1999)；Brennan等人，145微生物学211-20(1999))以及于马铃薯块茎稳定表达的蛋白质(Arakawa等人，6转基因研究403-13(1997)；Arakawa等人，16自然生技292-97(1998)；Tacket等人，4自然药物607-09(1998))。重组蛋白质也可将目标锁定于种子、叶绿体或分泌来识别可获得最高度蛋白质蓄积程度的所在位置。多方面努力探勘植物，意图对蛋白质制造问题获得生物技术的解决之道，已经将目光焦点集中于使用主要农作物。大半重点放在生物物质的制造，农业已经发展出全球最大型的生物物质制造系统，亦即农耕。过去7-8年间于农作物有许多外来蛋白质(例如疫苗、单株抗体、抗生物素及其它)范例。明白验证农业生产性植物可作为制造外来蛋白质的相当具有成本效益的手段。大多数情况下，对照于由典型发酵技术所得的产品，由此种植物制造产品的成本估计指出，使用植物可让成本降低50至100倍。当考虑可栽种用来制造特定产物的全部土地面积时，确实基于植物的制造系统的产能显然较高。但至今为止此种系统及办法尚未能排除显著瑕疵及缺点。由于此种系统系用来制造供医药用途的高度经过调节的生物物质，但其最严重的缺点之一为户外制造系统本质上未经调节。由于户外条件多变，难以发展出一种有效符合CGMP方法，或可能难以在户外生长此种经过基因修改的有机体(GMOs)。过去数十年来，植物生技研究已经被初步发现使用一种小型而生长快速的杂草植物拟南芥属(水芹)大为推动其进展。此种植物用于实验室研究有多项优异品质。拟南芥属小型、生命周期短、种子产生能力大量、有相对小而不复杂的基因体，且容易藉多种方法做转化，已经有多种突变变异株。过去十年来拟南芥属基因体已经完全被测序，代表第一种高等植物的里程碑。由于这些理由，拟南芥属变成植物生技常用的研究有机体。但普遍了解此种小型杂草植物只能作为研究模式。如此拟南芥属通常只在研究室内探勘。对于特定农作物研究工程，由拟南芥属种属获得的知识典型用来更完整了解全球主要食物作物及园艺作物，且该项了解应用于修改及改进该等作物种属。专利技术概述制造生物医药或诊断材料时，有多项关键因素需要考虑包括生长条件、产品制造及调节需求。根据本专利技术方法提供一种高度可靠而快速的系统，该系统可由早期的试验阶段及雏型阶段放大规模直到全规模制造重组蛋白质。很少有植物像拟南芥属(Arabidopsis)般适合快速产生植株及种子。就一方面而言，本专利技术提供一种经由筛选可表达高产率蛋白质的基因构建体及转基因植物，而由拟南芥属大规模制造重组蛋白质的方法。任一种适当技术皆可使用例如土壤杆菌(Agrobacterium)花浸渍或真空浸润转化程序。较好由转化至转基因种子所需时间少于10周，例如约8至10周。另一方面，使用快速暂时性表达分析系统，例如叶及幼苗浸润或原生质体电穿孔，而在其制造的数日内试验新颖基因构建体的适当性质。用来导入此种重组基因构建体的载体包括有用序列，这些有用序列包括但非限于有助于特定整合于选定的基因体所在位置的位置特异性重组位置，使用的可选择标记(例如BAR、NPTII等)及/或其它可筛选标记例如GFP(绿萤光蛋白质或其突变形式或修改形式)、虫萤光素酶或GUS(β葡萄糖醛酸酶)。较好重组构建体包含感兴趣蛋白质的编码核酸序列、以可操作方式连接至启动子及/或一或多个基因调节元件例如IRES(内部核糖体进入位置)。一方面，突变重组蛋白质藉随机突变发生、或藉合理设计、或藉这些技术的组合筛选而识别构建体，该构建体的蛋白质具有例如稳定性增高以及活性增高等期望性质。表达此种蛋白质的重组构建体较好是在暂时性检定分析平行于可表达野生性蛋白质形式的构建体一起试验。另一种产生可用于此类型生物「类似物」试验的变异株的方式系改变制造系统中影响终产物改变的某些参数。此种方式方便于拟南芥属达成，使用既存的拟南芥属变种、或产生植物的蛋白质处理特性变更的突变种。如此任何增加至制造新蛋白质系统的DNA信息皆可依据宿主植物的能力做些微变更，来进行某些翻译或翻译后修饰。糖基化作用属于与此处讨论特别有关的范例。已知于糖基化作用期间将糖添加至蛋白质在动植物间有别。核心聚糖大致相同，但主要差异在于添加木糖以及a-1-3岩藻糖以及不含末端唾液酸。尚未确定何种(若有)以及多少差异将有关植物产物用作为医药分子的功效及安全性。有足够参考文献提示此种变化对活性及安本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种于拟南芥属制造大量重组蛋白质的方法包含：（ａ）将至少一个可表达重组蛋白质的表达暗盒导入拟南芥属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）细胞；（ｂ）识别可表达期望程度及／或活性重组蛋白质的细胞；（ｃ）由细胞子代获得拟南芥属种子； （ｄ）于可快速产生种子的条件下培养种子；以及（ｅ）筛选得自该种子的植株，识别何种植株可表达期望程度及／或活性的重组蛋白质；（ｆ）于可快速产生种子的条件下培养至少二世代蛋白质产生性植株且选择蛋白质产量最高的植株；以及　 　（ｇ）于可制造至少约５０克生物物质／平方呎的条件下，培养可表达最高量蛋白质的植物种系。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：N拜斯可，M波西，M史卡金斯凯，L海洛雅马，G赫尔，T佩帝，A哥洛可，M肯普，
申请(专利权)人：爱康遗传科技公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]