香蕉枯萎病抗性分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记，该分子标记具有如SEQ ID：4所示的核苷酸序列。本发明专利技术还公开一种用于扩增SCAR分子标记的引物、包含引物的试剂盒以及上述分子标记、引物、试剂盒在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉中的应用。本发明专利技术还公开一种鉴定香蕉枯萎病抗性的方法，以香蕉叶片DNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增反应并检测扩增产物，具体表现为检测296bp特异性条带的有无。本发明专利技术提供的SCAR分子标记，为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术，进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及物理化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选。

Molecular markers and application of resistance to Fusarium Wilt of banana

SCAR molecular marker of the invention discloses a method for identification of Banana Fusarium wilt disease resistance, the molecular marker has the nucleotide sequence of SEQ is shown in ID:4. The invention also discloses a primer for amplification of SCAR molecular markers, a kit containing primers, and the application of the above molecular markers, primers and kits in identifying Banana Fusarium wilt resistance or screening blight resistant bananas. The invention also discloses a method for identifying resistance to Fusarium Wilt of banana. Taking banana leaf DNA as template, the above primers are used for PCR amplification reaction and detection of amplification products, specifically for detecting 296bp specific bands. The SCAR molecular marker provided by the invention provides molecular assistant technology for the breeding of banana disease resistant new varieties, and can further be used for auxiliary screening of Banana New Varieties (lines) which are screened by banana tissue culture seedling, banana field variation strain and physical and chemical mutation offspring.

【技术实现步骤摘要】
香蕉枯萎病抗性分子标记及其应用
本专利技术涉及香蕉枯萎病抗性分子标记，具体涉及一种香蕉枯萎病抗性鉴定的SCAR分子标记、分子标记引物、试剂盒、应用及方法。
技术介绍
香蕉是世界重要的一种水果，全世界栽培香蕉的国家达到130个。香蕉出口是热带亚热带地区创汇的主要手段，在其国民生产总值中占有相当的比重。我国是香蕉的主产国之一，香蕉产业在我国南亚热带地区农业产值中占有很重要的位置。香牙蕉(MusaAAACavendishsubgroupcv.)是世界第一大种植品种，也是我国主栽的香蕉类型。但是香牙蕉受到香蕉枯萎病4号生理小种的严重侵害，甚至是毁灭性的危害。目前，香蕉枯萎病已成为香蕉产业发展最大的障碍，受到国际广泛关注。该病害是一种土传病害，通过化学防治和农业防治尚不能有效地防控此病。种植香蕉枯萎病抗病品种是经济有效的途径，因此，香蕉枯萎病抗病品种选育是当前香蕉产业中重要的环节。目前生产上应用的栽培香蕉多数为三倍体(2n＝3x＝33)，具有单性结果、多倍性、高度不育、没有种子等特性，这为香蕉的常规杂交育种带来了极大的困难，抗病育种就更困难了。目前香蕉新品种选育途径主要是田间变异、组织培养变异利用、物理化学诱变等，但变异率较低，其中有用的变异率更低，并且筛选需要的人力物力大、选育周期长，造成了香蕉品种更新慢，病虫害高发的现状。随着当今生物技术的迅速发展，香蕉分子生物学技术逐步受到研究者重视。香蕉的抗病分子育种是研究热点和重点，但是还处于起步阶段，目前的研究主要集中在对香蕉的抗病基因类似物分析、香蕉抗病相关分子标记开发以及香蕉抗病机理等研究方面。孟祥春等(2007，分子植物育种S1：57-60)利用植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物，从香蕉抗枯萎病(4号小种)材料基因组中扩增，获得了4个抗病基因类似物(RGAS)，并发现均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性。袁克华等(2009，中国农学通报25(05)：271-274)根据R基因结构域的保守序列设计引物，以外源水杨酸诱导的香蕉为材料，在香蕉的基因组中扩增，获得了与植物抗病基因同源的序列BRGA1，并发现BRGA1在香蕉中受水杨酸调控，属诱导型表达。曾蕊等(2014，华中农业大学学报33(2)：61-64)利用香蕉组培苗人工接种试验研究香蕉被枯萎病菌4号小种侵染后防御酶活性的变化规律，发现苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)这四种酶都积极参与了香蕉苗体内的抗病反应。李赤等(2010，中国农学通报26(17)：251-255)研究抗感香蕉品种在接种香蕉枯萎病菌后防御酶系的变化，PAL酶、β-1，3-葡聚糖酶和外切几丁质酶可以作为香蕉品种抗枯萎病一个重要的生物化学标。王卓等(2013，中国农学通报29(34)：115-121)通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得1个过氧化物酶基因，命名为MaPOD1。当受到枯萎病侵染时，耐病品种中该基因的表达高于感病品种，可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。香蕉的抗病机理是一个复杂的过程，涉及的相关基因很多。谢江辉等(2008)等公开了两对引物，主要应用于“威廉斯”香蕉的芽变植株的抗病性鉴定。香蕉的枯萎病抗病机理较为复杂，抗病相关的基因较多，目前能够直接有效的用于香蕉育种中分子手段还比较少，因此急需对香蕉抗病机理进行多方面研究，开发多种抗枯萎病香蕉的鉴定方法，这方面的研究对香蕉的抗病育种具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记、分子标记引物、试剂盒以及鉴定香蕉枯萎病抗性的方法。本专利技术的目的之二在于提供一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记、分子标记引物以及试剂盒在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选能够抗枯萎病的香蕉中的应用。为实现上述目的，本专利技术提供一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记，其特征在于：所述SCAR分子标记具有如SEQID：4所示的296bp核苷酸序列。具体地，所述SCAR分子标记来源于如SEQID：1所示的SRAP分子标记。具体地，所述SCAR分子标记具有296bp的特异性条带，所述特异性条带的核苷酸序列如SEQID：4所示。该SCAR分子标记扩增出的目的条带为单条带，条带稳定性好，重现性高，分析简单快速，且其核苷酸序列较短，PCR扩增所需时间更少，操作更加简单，可更快速、更高效地实现对香蕉枯萎病抗性的鉴定。本专利技术还提供一种用于扩增上述所述分子标记的引物。具体地，所述引物的核苷酸序列如SEQID：2和SEQID：3所示，利用该引物对可扩增获得如SEQID：4所示的核苷酸序列。本专利技术还提供一种鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的引物。具体地，所述试剂盒除包含上述引物外，还包括10×PCRbuffer(含Mg2+)，dNTPs及TaqDNA聚合酶。更具体地，所述试剂盒包括10×PCRbuffer(含Mg2+)1mL，SCA11(10μM)300μl，SCA12(10μM)300μl，dNTPs(2.5nM)600μl，TaqDNA(5U/μl)100μl以及ddH2O5mL。本专利技术还提供一种所述引物在制备鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉的试剂盒中的应用。以及，所述分子标记、所述引物、或所述试剂盒在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉中的应用。具体地，所述香蕉为香牙蕉。本专利技术还提供一种鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉的方法，所述方法包含以下步骤：(1)提取香蕉叶片DNA；(2)以香蕉叶片DNA为模板，用所述引物进行PCR扩增反应；(3)检测扩增产物，具体表现为检测296bp特异性条带的有无。此鉴定方法只需提取香蕉叶片DNA即可对香蕉枯萎病进行鉴定，包括香蕉吸芽苗与组培苗，可实现在任何生长期对香蕉枯萎病抗性的鉴定。具体地，若检测到所述的296bp的特异性条带，则香蕉枯萎病抗性为感病，若未检测到所述的296bp的特异性条带，则香蕉枯萎病抗性为抗病。具体地，所述的鉴定香蕉枯萎病抗性的方法，所述PCR扩增反应体系包括，PCRbuffer、dNTPs、SCAR特异性引物SCA11/SCA12、DNA及TaqDNA聚合酶。较佳地，在步骤(2)中，所述PCR扩增反应为20μl体系，10×PCRbuffer(含Mg2+)2μl，dNTPs(2.5nM)2μl，SCAR特异性引物SCA11/SCA12(10μM)分别1μl，DNA(50ng/L)1μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl及灭菌的ddH2O12.7μl；所述PCR扩增反应程序为，94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，72℃延伸10min。具体地，所述检测扩增产物的方法为在1.2％的琼脂糖凝胶，110v电压电泳25分钟，在凝胶成像仪观察照相，若检测到所述的296bp的特异性条带，则香蕉枯萎病抗性为感病，若未检测到所述的296bp的特异性条带，则香蕉枯萎病抗性为抗病。本专利技术提供的鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记解决了现有技术中香蕉枯萎病传统盆栽接种鉴定、水培接种鉴定与病地种植鉴定的局限性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记，其特征在于：所述SCAR分子标记具有如SEQ ID：4所示的296bp的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
2017.10.17 CN 20171096300961.一种鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记，其特征在于：所述SCAR分子标记具有如SEQID：4所示的296bp的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的鉴定香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记，其特征在于：所述SCAR分子标记来源于如SEQID：1所示的SRAP分子标记。3.一种用于扩增如权利要求1所述SCAR分子标记的引物。4.如权利要求3所述的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如SEQID：2和SEQID：3所示。5.一种鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求3～4任一项所述的引物。6.如权利要求3～4任一项所述引物在制备鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉的试剂盒中的应用。7.如权利要求1～2任一项所述分子标记、如权利要求3～4任一项所述引物、或如权利要求5所述试剂盒在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉中的应用。8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述香蕉为香牙蕉。9.一种鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，夏玲，吕顺，胡贝，曾莉莎，刘建平，
申请(专利权)人：东莞市香蕉蔬菜研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44