一株有效防治黄瓜枯萎病的青霉菌制造技术

本发明专利技术属于微生物学领域，公开了一株青霉菌NSY15，分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)，于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13188。该青霉菌菌株NSY15分离自酒糟基质，能够有效防治黄瓜枯萎病，防治效果达到52.39％，并且NSY15能够溶解基质中的无机磷，提高土壤中有效磷水平，从而促进黄瓜的生长，适宜作为农业菌剂加以开发利用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物学领域，涉及一株青霉菌的分离及应用。特别是涉及一株能有效抑制黄瓜枯萎病菌生长的青霉菌。
技术介绍
黄瓜枯萎病是一种世界性的毁灭性土传真菌病害，在我国各地均有发生。黄瓜枯萎病的病原菌是尖抱镰刀菌黄瓜专化型，病原菌从根部伤口和根毛生长点侵入植株，进而破坏其根、茎和叶的维管束，使黄瓜植株吸收和运输水分功能丧失，最终造成黄瓜植株枯萎死亡。枯萎病一般可造成黄瓜产量下降10％～30％，严重时可达80％～90％是黄瓜病害中最为严重、造成经济损失最大的病害之一。黄瓜是我国重要的经济作物之一，随着黄瓜种植面积的逐年扩大，由此带来的连作重茬导致黄瓜枯萎病日益加重。因此，深入研究有效防治黄瓜枯萎病的方法己成为当前生产上亚待解决的重要问题。因为化学药剂的长期不合理的使用已经造成众多环境问题。同时还会引发抗药性，农药残留等问题。培育抗病品种虽然是最好的途径，但是由于抗病品种的选育困难难以选出有效且抗性稳定的品系。生物防治以其良好的防治效果以及安全无公害的特点越来越受到人们的重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株防治黄瓜枯萎病的单一生防菌株及其应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一株青霉菌NSY15，分类命名为青霉菌(Penicilliumsp.)，于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCCNo.13188。专利技术人采用平板对峙法，自酒糟基质中分离、筛选出对黄瓜枯萎病菌拮抗菌株，命名为NSY15。通过对菌株NSY1518SrDNA序列测定及系统进化分析将其鉴定为青霉菌(Penicilliumsp)。本专利技术所述的青霉菌NSY15为一种能够溶解无机磷菌株，具有一定的融磷作用能够溶解基质中难溶性磷，促进植物营养物质的吸收，从而促进植物的生长，可以作为植物生长促生菌。本专利技术所述的青霉菌NSY15在促进植物生长中的应用。所述的植物可以为黄瓜。本专利技术所述的青霉菌(Penicilliumsp)NSY15在防治黄瓜枯萎病中的应用。能有效抑制黄瓜枯萎病菌的生长，对黄瓜枯萎病具有良好的防治效果。所述的黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病。本专利技术的另一个目的是提供一种含有本专利技术青霉菌NSY15的菌剂，所述的菌剂中孢子浓度为1×107～1×108个孢子/ml。所述的含有青霉菌NSY15的菌剂的制备方法没包括：在PDA培养基，生化培养箱28℃培养7天，用无菌水冲洗菌落表面，制成孢子悬浮液，调节孢子浓度为1×107～1×108个孢子/ml即得。本专利技术所述的含有青霉菌NSY15的菌剂在促进植物生长中的应用。本专利技术所述的含有青霉菌NSY15的菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。本专利技术的有效果：本专利技术青霉菌NSY15分离自酒糟基质，能有效抑制黄瓜枯萎病菌的生长，对黄瓜枯萎病具有良好的防治效果，防治效果达到52.39％，并且NSY15具有一定的融磷作用能够溶解基质中难溶性磷，促进植物营养物质的吸收，从而促进植物的生长。青霉菌NSY15适宜作为农业菌剂加以开发利用。附图说明图1为青霉菌(Penicilliumsp)NSY15在PDA培养基上生长的菌丝形态。图2为青霉菌(Penicilliumsp)NSY15对黄瓜枯萎病菌拮抗作用示意图。图3为根据青霉菌(Penicilliumsp)NSY1518SrDNA序列构建的系统发育树。图4为青霉菌(Penicilliumsp)NSY15融磷作用图。生物材料保藏信息NSY15，分类命名为Penicilliumsp.，于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.13188。具体实施方式下面结合具体实施，具体阐述本专利技术，所述是对本专利技术的解释而不是限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。实施例1生防菌的分离采集南京农业大学牌楼教学基地发酵后的酒糟基质10g，加入到盛有90mL无菌水的500ml三角瓶中，将三角瓶置摇床上，180r/min振荡20min，制成基质悬液。将制备好的悬液静置10min，采用10倍系列稀释法，依次配制成10-2、10-3、10-4和10-5系列的稀释液，移液枪分别吸取1ml不同系列的稀释液涂布于含有100mg·l-1硫酸链霉素的PDA培养基上，将PDA培养基平板用封口膜封好后，置于28℃的培养箱内培养7天左右。待平板上长出真菌后，挑取对周边的真菌具有明显抑制效果的真菌为目标真菌，进行下一步复筛。在直径为9cm的固体PDA培养基平板上的一端接入直径为5mm的打孔器打制成的供试植物病原菌(尖孢镰刀菌黄瓜专化型，Fusariumoxysporum.sp.cucumebriumOwen，FOC)菌斑，在病原菌四周接入直径为5mm的打孔器打制成的青霉菌菌斑，两菌株接种点距离相距3cm。以只接种供试植物病原菌作为对照试验(图2右图)。将PDA培养基平板用封口膜封好后，置于28℃的培养箱内培养7天左右，通过观察抑菌圈和抑菌带的有无进一步确认所筛选的真菌对枯萎病菌的拮抗能力，筛选出对黄瓜枯萎病具有良好抑菌效果的生防菌(图2左图)，命名为NSY15。NSY15的菌落特征：菌落表面无不规则皱纹，中心有脐状突起；质地绒状，菌落表面有明显环状，外缘为白色，菌丝体白色，菌落青绿色，无明显渗出液，背面菌落为黄褐色。NSY15显微镜镜检特征(如图1)：在PDA培养基，生化培养箱28℃培养7d，菌丝无色，有隔膜；分生抱子梗单枝，抱子梗顶端膨大，排列成帚状的间枝，对称，顶层为小梗，上生分生抱子串，单个分生抱子为球形或椭圆形。菌株NSY15的鉴定真菌DNA的提取采用OMEGA真菌DNA提取试剂盒提取。采用真菌18SrDNA扩增的常用引物对NS1：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'。25μlPCR反应体系为：l0×PCRBuffer(含Mg2+)5μl,dNTP(10mM)1μl，上、下游引物(10pM)各1μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，DNA模板1μl，无菌水15.5μl。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃保温5min。反应结束后，取7μlPCR扩增产物与1μl6×loadingbuffer混合点样，100V电压电泳30min-40min，然后在紫外灯下拍照观察结果。将特异性好且纯度较高的PCR扩增产物送往测序公司测序，所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对，根据比对的结果从GenBank中选取合适的序列，构建系统发育树。经测定NSY1518SrDNA序列长为1662nt，具体序列如SEQ.NO.1所示。在根据18SrDNA序列构建的系统树中，NSY15与青霉菌(Penicilliumsp)聚类到一支(图3)。通过对菌株NSY1518SrDNA序列测定及系统进化分析将菌株NSY15鉴定为青霉菌(Penicilliumsp)。该菌株于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.13188。实施例2青本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株青霉菌NSY15，分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)，于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13188。

【技术特征摘要】
1.一株青霉菌NSY15，分类命名为青霉菌(Penicilliumsp.)，于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.13188。2.权利要求1所述青霉菌NSY15在效防治黄瓜枯萎病中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型病菌引...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭世荣，李舒展，杜南山，施露，孙锦，束胜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32