一种牙本质牙髓复合体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种牙本质牙髓复合体的制备方法，包括如下步骤：1）经过患者知情同意，收集口腔医院外科门诊因正畸拔出的无龋坏前磨牙，去除软组织，清洗干净后‑80°C冰箱保存备用；2）制备时取出样本牙齿，在低速硬组织切片机上切除冠部釉质部分，留取髓腔顶部至冠部的牙本质层，厚1.5 mm；3）将获得的牙本质继续切割为2 mm长×2 mm宽×2 mm高的牙本质片；4）将牙本质小块浸泡于5~20%w/w EDTA溶液中10 min，PBS洗5 min×3次，19%w/w柠檬酸溶液浸泡1 min，PBS洗5 min×3次。本发明专利技术具有如下有益结果：1）通过标准化制备方法，可以提高相关研究的重复性和科学性。2）利用此标准化制备方法，可以检测实验中种子细胞的牙向分化潜能。

A method for the preparation of dentin pulp complex

The present invention provides a method for preparing dentin pulp complex, which comprises the following steps: 1) after informed consent, collect oral hospital out-patient for caries free premolars for orthodontic pull-out, removal of soft tissue, after cleaning 80 C refrigerator for standby; 2) took out the sample preparation the teeth crown in the low part resection of enamel hard tissue slicing machine, leaving the dentin layer from the top to the medullary cavity of the crown, the thickness of 1.5 mm; 3) will continue to get the dentin cutting into dentin pieces 2 x 2 mm long mm wide x 2 mm; 4) the small dentin was soaked in 5~20%w/w solution for 10 EDTA min, PBS min wash 5 * 3 times, 19%w/w citric acid solution for 1 min, PBS washed 5 min * 3 times. The present invention has the following beneficial results: 1) the repeatability and scientificity of the related research can be improved by the standardized preparation method. 2) using this standardized preparation method, the potential of the tooth differentiation of the seed cells in the experiment can be detected.

【技术实现步骤摘要】
一种牙本质牙髓复合体的制备方法
本专利技术涉及一种组织工程复合体的制备方法，尤其是牙髓再生相关组织工程复合体的制备，具体的说是一种牙本质牙髓复合体的制备方法。
技术介绍
伴随着组织工程技术的快速发展和广泛应用，支架材料也得到了不同程度的改进和更新。在牙髓组织工程中通过使用能维持干细胞生存以及血管和神经再生的多孔支架，可以让组织工程牙髓进入临床应用变得更为现实。因为支架不仅可以替代组织基本的机械和生物学功能，还可以含有帮助干细胞增殖和分化的生长因子、细胞因子甚至DNA片段，从而控制引导目的组织更好、更快地发育成形。在牙髓暴露的牙齿中，发现牙本质碎片能够诱导修复性牙本质桥的形成。进一步研究表明，牙本质碎片可能为牙髓干细胞的粘附提供了基质或者含有指导再生修复过程的信号因子，从而实现修复性牙本质再生。牙本质碎片在天然牙髓干细胞修复活动中发挥的作用，说明在牙本质牙髓复合体再生研究中使用支架材料的必要性。目前，比较常用的支架材料如HA/TCP、PGA、水凝胶、胶原，多孔陶瓷及纤维性钛网等，虽然这些材料都能维持种子细胞的贴附、生长甚至分化，而且将这些组织复合种子细胞移植到体内，均能形成牙本质牙髓样结构并表达牙本质涎蛋白。但是这些支架材料很难形成合适的孔径率和孔径大小，以便于细胞和营养物质的进入和扩散，以及代谢物质的排除。而且体内所形成的牙本质牙髓样结构并不能实现成牙本质细胞层、前期牙本质层及成熟牙本质层的有序规则排列。因此，需要找到一种更适合的牙髓组织再生支架材料。牙本质作为成牙本质细胞分泌的细胞外矿化基质，天生具有与成牙本质细胞相匹配的孔径大小及孔隙率。体外单纯应用不仅能诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化，还能诱导牙囊细胞向成牙本质细胞分化甚至分泌矿化基质。有学者将乳牙牙髓干细胞复合可降解的支架材料，填入牙本质腔内整体移植到免疫缺陷小鼠体内，4周后在原来的牙本质腔内侧不仅出现了牙本质牙髓样结构，而且在形成的牙髓样组织中还出现了新生血管。另外，单纯将牙本质片与牙囊细胞复合后体内移植，不仅形成了牙本质牙髓样结构，而且成牙本质细胞层、前期牙本质层实现了规则有序的排列。这些实验结果很大程度上促进了牙本质片在牙髓组织再生中的应用。除了矿化基质，牙本质中还含有30%蛋白成分，而最主要的就是胶原和非胶原蛋白，其中包括牙本质涎蛋白、牙本质磷蛋白和各种多肽生长因子，部分蛋白已被证实可作为细胞因子诱导牙本质周围的多种成体干细胞分化。这些贮藏于牙本质和骨组织中的多肽有信号趋化、诱导细胞活性与分化的作用，参与了牙及骨的形成过程。例如，牙本质组成成分中的局部转化生长因子和血小板衍生生长因子等均能以自分泌、旁分泌的方式调节周围细胞的增殖、分化以及组织改建。综上所述，天然牙本质可以作为组织工程牙髓再生的支架材料并提供牙髓样组织再生的诱导微环境，复合种子细胞细胞团，体内可以形成牙本质牙髓复合体结构。因此，构建一个标准化的牙本质牙髓复合体制备程序，将有利于促进牙髓再生相关组织工程的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用既往文献报道及前期研究结果构建一个标准化的牙本质牙髓复合体制备方法，从而为后续的牙及牙相关组织再生提供一个技术手段或创新平台。本专利技术的技术方案如下：一种牙本质牙髓复合体的制备方法，包括如下步骤：1）经过患者知情同意，收集口腔医院外科门诊因正畸拔出的无龋坏前磨牙，去除软组织，清洗干净后-80°C冰箱保存备用；2）制备时取出样本牙齿，在低速硬组织切片机上切除冠部釉质部分，留取髓腔顶部至冠部的牙本质层，厚1.5mm；3）将获得的牙本质继续切割为2mm长×2mm宽×2mm高的牙本质片；4）将牙本质小块浸泡于5~20%w/wEDTA溶液中10min，PBS洗5min×3次，19%w/w柠檬酸溶液浸泡1min，PBS洗5min×3次；5）移入超净台中，75%乙醇浸泡3min，无菌PBS洗5min×3次，含双抗的PBS浸泡3min，普通无菌PBS洗5min×3次，-20°C保存备用；所述的含双抗的PBS中双抗为青霉素和链霉素，青霉素含量为500U/mL，链霉素含量为500μg/mL；6）取生长稳定的第2~4代牙髓细胞，消化、离心，用滴管将离心管底部的细胞轻轻吹起，制备成悬浮的细胞团，细胞总数为5×106个；7）用眼科剪制备一含有空腔且大小为4mm长×4mm宽×4mm高的明胶海绵，用滴管将细胞团轻轻吸出滴入到空腔中，加入准备好的牙本质片，保持明胶海绵湿润，置于培养皿中，移入细胞培养箱等待移植；8）用戊巴比妥钠全麻实验用SD大鼠，戊巴比妥钠用量30mg/kg，固定于手术台上，无菌条件下切开皮肤、肌肉找到肾脏，用玻璃探针划开肾脏表面的筋膜；9）将37°C孵箱中的含牙本质片和细胞的明胶海绵整体移植入一侧肾被膜下；10）待实验用大鼠清醒后，移入动物房常规饲养6周；11）6周后脱颈处死实验用大鼠，逐层解剖至肾被膜，取出植入组织，置于2~5%v/v多聚甲醛溶液中固定，脱矿，石蜡包埋，切片，HE染色，鉴定所形成的组织结构。所述的步骤4）中，EDTA溶液浓度为17%w/w。所述的步骤6）中，取生长稳定的第3代牙髓细胞。所述的步骤11）中，多聚甲醛溶液浓度为4%v/v。本专利技术的创新点在于以天然牙本质为支架材料的体内移植及移植前牙本质的处理方法，现有技术尚未有直接移植天然牙本质的，大都是移植细胞和HA/TCP支架材料，本专利技术用的支架材料是天然牙本质，然后与细胞复合，一起移植到体内检测体内环境中天然牙本质对细胞的诱导作用。本申请利用天然牙本质作为支架材料进行体内诱导实验，开创了一种新的实验方式，该方法操作简单，支架材料也容易获得。天然牙本质可以作为支架材料复合不同的细胞进行体内移植，以检测不同细胞的牙向分化能力。本专利技术具有如下有益结果：1）通过标准化制备方法，可以提高相关研究的重复性和科学性。2）利用此标准化制备方法，可以检测实验中种子细胞的牙向分化潜能。3）大鼠肾被膜下环境是免疫优惠区，血运丰富且便于移植后组织定位，该牙本质牙髓制备方法中，移植物整体体积小可以置于大鼠肾被膜下而无需使用裸鼠，节约了实验成本，并能获得类似的实验结果，且成功能率更高。4）该方法使用经过预处理的天然牙本质块作为刺激物，利用了其多孔蜂窝样结构，其本身富含多种活性蛋白组分，将物理微环境与化学微环境完美结合，创新性明显，可以以此结论解释部分临床问题并拓宽牙髓再生研究思路。附图说明图1是牙本质牙髓复合体制备简要流程图。图2是BMMSCs/牙本质片体内移植后，各样本的免疫组织化学染色结果。A：DSP在阳性对照组的前期牙本质及成牙本质细胞中呈阳性表达（×200）；B：有BMMSCs复合的牙本质片外侧的近似高柱状排列的细胞DSP呈阳性表达（×100）；C：无BMMSCs复合的牙本质片周围组织未见DSP表达（×200）；D：肾脏阴性对照组标本无DSP表达（×200）；I：单独细胞团对照组无DSP表达（×200）；E、F、G、H和J：A-D及I对应的PBS对照组无异常着色。图3A是BMMSCs与牙本质片复合后的体内各组样本DSP蛋白表达水平结果；图3B是BMMSCs与牙本质片复合后的体内各组样本Dspp基因表达水平结果；图3C是BMMSCs与牙本质片复合后的体内各组样本相对蛋白表达量；(***表示P&a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牙本质牙髓复合体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）经过患者知情同意，收集口腔医院外科门诊因正畸拔出的无龋坏前磨牙，去除软组织，清洗干净后‑80 °C冰箱保存备用；2）制备时取出样本牙齿，在低速硬组织切片机上切除冠部釉质部分，留取髓腔顶部至冠部的牙本质层，厚1.5 mm；3）将获得的牙本质继续切割为2 mm长×2 mm宽×2 mm高的牙本质片；4）将牙本质小块浸泡于5~20%w/w EDTA溶液中10 min，PBS洗5 min×3次，19% w/w柠檬酸溶液浸泡1 min，PBS洗5 min×3次；5）移入超净台中，75%乙醇浸泡3 min，无菌PBS洗5 min×3次，含双抗的PBS浸泡3 min，普通无菌PBS洗5 min×3次，‑20°C保存备用；所述的含双抗的PBS中双抗为青霉素和链霉素，青霉素含量为500 U/mL，链霉素含量为500 μg/mL；6）取生长稳定的第2~4代牙髓细胞，消化、离心，用滴管将离心管底部的细胞轻轻吹起，制备成悬浮的细胞团，细胞总数为5×10

【技术特征摘要】
1.一种牙本质牙髓复合体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）经过患者知情同意，收集口腔医院外科门诊因正畸拔出的无龋坏前磨牙，去除软组织，清洗干净后-80°C冰箱保存备用；2）制备时取出样本牙齿，在低速硬组织切片机上切除冠部釉质部分，留取髓腔顶部至冠部的牙本质层，厚1.5mm；3）将获得的牙本质继续切割为2mm长×2mm宽×2mm高的牙本质片；4）将牙本质小块浸泡于5~20%w/wEDTA溶液中10min，PBS洗5min×3次，19%w/w柠檬酸溶液浸泡1min，PBS洗5min×3次；5）移入超净台中，75%乙醇浸泡3min，无菌PBS洗5min×3次，含双抗的PBS浸泡3min，普通无菌PBS洗5min×3次，-20°C保存备用；所述的含双抗的PBS中双抗为青霉素和链霉素，青霉素含量为500U/mL，链霉素含量为500μg/mL；6）取生长稳定的第2~4代牙髓细胞，消化、离心，用滴管将离心管底部的细胞轻轻吹起，制备成悬浮的细胞团，细胞总数为5×106个；7）用眼科剪制备一含有空腔且大小为4...

【专利技术属性】
技术研发人员：于金华，雷港，周洲，张光东，庄颖，许涛，闫明，景双林，
申请(专利权)人：南京医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32