一种利用PacBio单分子测序批量高精度获得昆虫COI基因条形码区域的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用PacBio单分子测序批量高精度获得昆虫COI基因条形码区域的方法。本发明专利技术提供的方法包括如下步骤：(1)将多个昆虫的DNA样本分别进行PCR扩增；正向引物依次包括正向标签和对应于昆虫COI基因的正向片段，反向引物依次包括反向标签和对应于昆虫COI基因的反向片段；正向引物中的正向片段均相同，反向引物中的反向片段均相同；每两个正向引物的正向标签之间至少具有2个核苷酸的差异；每两个反向引物的反向标签之间至少具有2个核苷酸的差异；(2)分别取所有PCR扩增的扩增产物，混合，得到混合样本；(3)将混合样本进行第三代测序。本发明专利技术对于高通量获得昆虫COI基因条形码序列具有重大的应用推广价值。

A method of obtaining the bar code region of insect COI gene by PacBio single molecule sequencing batch high precision

The invention discloses a method of obtaining the bar code area of the insect COI gene by using the PacBio single molecule sequencing batch and high precision. The method provided by the invention comprises the following steps: (1) a plurality of insect DNA samples were amplified by PCR; the forward primer includes positive labels and corresponding to the insect COI gene positive fragments, including reverse primer reverse label and corresponding to the insect COI gene reverse fragment; forward primer in positive fragments were the same reverse fragments in reverse primers were the same; the difference of at least 2 nucleotides with each two forward primers positive labels; the difference of at least 2 nucleotides with a reverse label every two reverse primers; (2) were all amplified by PCR amplification, mixing, mixing samples (; 3) the mixed samples of the third generation sequencing. The invention has great application and popularization value for high throughput acquisition of the bar code sequence of insect COI gene.

【技术实现步骤摘要】
一种利用PacBio单分子测序批量高精度获得昆虫COI基因条形码区域的方法
本专利技术涉及一种利用PacBio单分子测序批量高精度获得昆虫COI基因条形码区域的方法。
技术介绍
DNA条形码(DNAbarcode)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。加拿大动物学家PaulHebert等对动物界的包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因序列比较分析发现，除腔肠动物Cnidaria外，98％的物种的遗传距离差异，种内为0％～2％，种间平均可达到11.3％，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种，作为物种的条形编码，即为DNA条形码。在过去的十多年里，科学家在构建精心选择的DNA标记方面做出了巨大努力。例如，生命的国际条形码(iBOL，www.ibol.org)项目在通过很多年的积累之后，已经得到了覆盖约20万种的4,694,277条序列(BOLD，在2016年10月访问)，包括细胞色素氧化酶C亚基I(COI)作为动物条码标记，核内转录间隔区(ITS)作为真菌的条形码，rbcL基因、matK基因作为植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得昆虫的COI基因条形码序列的方法，包括如下步骤：(1)将多个昆虫的DNA样本分别进行PCR扩增；每个PCR扩增的引物对均由正向引物和反向引物组成，正向引物自5’末端至3’末端依次包括正向标签和对应于昆虫COI基因的正向片段，反向引物自5’末端至3’末端依次包括反向标签和对应于昆虫COI基因的反向片段；所有PCR扩增的正向引物中的正向片段均相同，所有PCR扩增的反向引物中的反向片段均相同；所有PCR扩增的正向引物中，每两个正向引物的正向标签之间至少具有2个核苷酸的差异；所有PCR扩增的反向引物中，每两个反向引物的反向标签之间至少具有2个核苷酸的差异；(2)分别取步骤(1)得到的所有PCR...

【技术特征摘要】
1.一种获得昆虫的COI基因条形码序列的方法，包括如下步骤：(1)将多个昆虫的DNA样本分别进行PCR扩增；每个PCR扩增的引物对均由正向引物和反向引物组成，正向引物自5’末端至3’末端依次包括正向标签和对应于昆虫COI基因的正向片段，反向引物自5’末端至3’末端依次包括反向标签和对应于昆虫COI基因的反向片段；所有PCR扩增的正向引物中的正向片段均相同，所有PCR扩增的反向引物中的反向片段均相同；所有PCR扩增的正向引物中，每两个正向引物的正向标签之间至少具有2个核苷酸的差异；所有PCR扩增的反向引物中，每两个反向引物的反向标签之间至少具有2个核苷酸的差异；(2)分别取步骤(1)得到的所有PCR扩增的扩增产物，混合，得到混合样本；(3)将混合样本进行第三代测序，得到多个昆虫的COI基因条形码序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多个昆虫为2-500个昆虫。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：每个PCR扩增的正向引物和反向引物中，正向标签和反向标签的核苷酸序列相同。4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：正向标签和反向标签均由4-10个核苷酸组成。5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：正向片段如序列表的序列1所示，反向...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘山林，杨琛涛，周程冉，周欣，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44