来自棉花恢复系中含有26S rRNA序列的基因制造技术

本发明专利技术涉及一个来自棉花恢复系中含有２６Ｓ核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）序列的新基因。该基因是通过抑制差减杂交的方法获得来自棉花恢复系的ＥＳＴ序列之后，以该ＥＳＴ序列设计引物再做５’和３’ＲＡＣＥ，从而获得其全长ｃＤＮＡ序列。该基因的３’端含有２６Ｓ　　ｒＲＮＡ序列，５’端是一个全新的序列。由于该基因来源于陆地棉（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）恢复系Ｙ１８Ｒ，并且编码３９２个氨基酸的蛋白质，因此将其命名为ＧＨ１８Ｒｏｒｆ３９２。该基因可用于棉花育性相关功能的研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一个来自棉花恢复系中含有26S核糖体RNA(rRNA)序列的新基因。该基因是通过抑制差减杂交的方法获得来自棉花恢复系的EST序列之后，以该EST序列设计引物再做5’和3’RACE，从而获得其全长cDNA序列。该基因的3’端含有26S rRNA序列，5’端是一个全新的序列。由于该基因来源于陆地棉(Gossypium hirsutum)恢复系Y18R，并且编码392个氨基酸的蛋白质，因此将其命名为GH18Rorf392。该基因可用于棉花育性相关功能的研究。
技术介绍
棉花具有十分明显的杂种优势，利用棉花杂种优势已成为一种提高产量、品质和抗病性的有效途径。由于棉花胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，简称CMS)在杂交优势利用中所占的地位，最初遗传育种工作者致力于收集选育不同作物的各种雄性不育种质，为生产应用和理论研究打下了基础。20世纪60年代以来，Meyer等人先后培育了具有异常棉(Gossypium.anomalum)、亚洲棉(G.arboreum)、哈克尼西棉(G.harknessii)胞质雄性不育系，并实现了三系配套。但存在恢复系狭窄、可育性不稳定、以及杂种优势不明显等问题。2005年中国农科院生物技术研究所郭三堆课题组的“转抗虫基因三系杂交棉分子育种体系”成果通过了国家鉴定，成功地创建了高产量、高纯度、高效率、大规模、低成本、能够直接应用的转抗虫基因三系杂交棉常规育种与分子育种相结合的新体系。核恢复基因(nuclear restorer gene for fertility，简称Rf基因)在CMS中所起的作用是不容忽视的。在Rf基因存在的核背景下，与CMS相关的线粒体DNA的突变表型可得到有效校正，花粉败育现象得到抑制，因而育性得以恢复。这就显示只有在真正了解恢复基因与线粒体CMS相关基因相互作用的情况下，才能完整地解释CMS分子机理，并进一步促进CMS在农业上的应用(徐秉芳，2000，植物生理学通讯，36(6)573-580)。然而，有关细胞质雄性不育线粒体基因组的研究已有很多论述，相比之下涉及核恢复基因的工作相当零散，其中有一部分是在研究不育线粒体基因组时附带提及的。归纳起来有关恢复基因的工作主要包括两个方面一是对比不育系在引入恢复基因前后，线粒体不育基因表达样式的差异，从而间接地探讨恢复基因调控线粒体CMS基因表达的机理；二是直接探讨核恢复基因的分子本质，尝试克隆恢复基因，以解释其恢复育性的功能。国内外对恢复基因的研究有报道称恢复基因调控线粒体CMS基因的表达。细胞质雄性不育可以自然发生，但更常见的是由于杂交使不亲和的核质共处一体，造成不育。针对特定的不育系，通常存在一至几个恢复育性的核基因(Schnable PS，Wise RP，1999，Trends PlantScience，3175-180)。一般来说，恢复基因是与不育基因不连锁的显性基因，已证明一些恢复基因可通过改变线粒体不育相关基因的表达而减弱、消除其毒害效应，以恢复花粉育性。已有的研究实例表明，恢复基因可能影响线粒体不育基因的转录本的稳定性(Young E，HansonM，1987，Cell，5041-49；Moneger F et al，1994，EMBO Journal，138-17)、转录后加工(Tang HV et al，1996，The Plant Journal，10123-133；Dill CL et al，1997，Genetics，1471367-1379；Landgren M et al，1996，Plant Molecular Biology，32879-890)、RNA编辑(Leon P et al，1998，Annual Review Plant Physiology Plant Molecular Biology，49453-480)、翻译后加工(Abad AD et al，1995，Plant Cell，7271-285)，甚至影响线粒体基因的组成形式(He S et al，1995，Genetics，139955-962)。克隆恢复基因是一项重要且颇具挑战性的工作，这一方面是由于没有同源序列和蛋白序列的资料，而常用的一些基因克隆策略难以运用；另一方面是因为其基因表型需要通过与胞质不育因子相互作用才能显现出来，这使突变体的分析更加复杂化，因此克隆恢复基因必须在技术手段上进行大胆尝试。到目前为止，已克隆的植物恢复基因有玉米(Zea mays L.)的Rf2基因(Cui et al，1996，Science，2721334-1336)、矮牵牛(Petunia hybrida L.)的Rf基因(Bentolila et al，2002，)、萝卜(Raphanus sativus L.)的Rfo和Rfk基因(Koizuka et al，2003，The Plant Journal，34407-415)以及水稻(Oryza sativa L.)的Rf-1基因(Komori et al，2004，The Plant Journal，37315-325)等。但是还未见到克隆出棉花育性恢复基因的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一个来自棉花恢复系中含有26S rRNA序列的新基因GH18Rorf392。该基因的全长为2039bp(如序列表SEQ ID NO1所示)，其含有一个1176bp的开放阅读框(ORF)结构(如序列表SEQ ID NO2所示)。该基因是通过抑制差减杂交的方法获得来自棉花恢复系的EST序列之后，以该EST序列设计引物再做5’和3’RACE，从而获得其全长cDNA序列。目前在国内外尚未见到有类似报道。本专利技术中的全长DNA序列整合到质粒中，转入大肠埃希氏菌中保藏，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得保藏编号CGMCCNo.2068，分类命名是Escherichia coli。本专利技术的另一个目的是提供一个新的来自棉花恢复系中含有26S rRNA序列的新基因GH18Rorf392所表达的蛋白质(如序列表SEQ ID NO2所示)。它具有392个氨基酸(如序列表SEQ ID NO2所示)。下面结合附图对本专利技术做进一步说明。附图表说明附图说明图1为运用抑制差减杂交的方法中第二次PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。图2为根据SSH序列设计引物进行RT-PCR验证的琼脂糖凝胶电泳图。图3为根据SSH序列设计引物进行快速扩增cDNA末端(RACE)的琼脂糖凝胶电泳图。图4为用Pst I和Not I双酶切鉴定连接克隆子的琼脂糖凝胶电泳图。图5为拼接完整的GH18Rorf392全长基因序列中用设计的引物进行第一次PCR的琼脂糖凝胶电泳图。图6为拼接完整的GH18Rorf392全长基因序列中用设计的引物进行第二次PCR的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施例方式实施例1运用抑制差减杂交的方法获得来自棉花恢复系的基因片断1用于抑制差减杂交的棉花材料的培育与取材棉花品种为中国农科院生物技术研究所郭三堆课题组培育的Y18R×P30A杂交F1代自交F2代材料。F1代自交材料播种后根据雄蕊形态学判断其育性，然后分别摘取可育和不育材料现蕾3～5天的幼蕾。用解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个基因全长ｃＤＮＡ序列，它具有如序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示的第１位至第２０３９位的核苷酸序列，其核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列与ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示的第１位至第２０３９位的核苷酸序列具有至少８０％以上的同源性，并同时具有相同功能的类似物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭三堆，吴巧雯，宋洋，张锐，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，郭三堆，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]