植物耐逆性相关转录因子ＧｍＷＲＫＹ５４及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物耐逆相关蛋白及其编码基因与应用。该植物耐逆性相关蛋白，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列表中序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与植物耐逆性相关的由序列２衍生的蛋白质。将该植物耐逆性相关蛋白的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因植物品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用，特别是来源于大豆的 耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
环境中物理化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发 育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目 标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细 胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因 表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如EREBP/AP2 中的DREB类，bZIP， MYB等等。WRKY类转录因子是植物转录因子中的一个大家族，仅拟南芥就含有100多种WRKY 成员，所有成员均含有一个或两个WRKY结构域，可与启动子中的W-box结合。WRKY家 族参与植物多种生物学功能，例如对病原菌的防卫、植物衰亡、形态发生以及对非生 物胁迫的应答等。W-box存在于许多与植物防御反应相关的基因启动子中，介导了病 原物来源的激发子诱导的转录反应。病毒、细菌和真菌激发子的侵染以及信号物质如 水杨酸的处理，也能够诱发TOKY转录因子的mRNA和蛋白质的合成，而且也能增强它与 DNA的结合活性。W-box和WRKY转录因子联合调控其下游基因产物从而起到保护和防卫 的作用。人们相继从不同植物中克隆得到在逆境下起作用的WRKY转录因子有拟南芥 AtWRKYs 、烟草NtWRKYs以及马铃薯StWRKY。尚未克隆大豆中与非生物胁迫相关的该 类转录因子。大豆是重要的油料作物，是植物蛋白质的主要来源，阐明其耐逆机理，进而改善 其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因。 本专利技术所提供的耐逆性相关蛋白，名称为GmWRKY54，来源于大豆，是如下(a) 或(b)的蛋白质(a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。 序列表中的序列2由323个氨基酸残基组成，是大豆中的WRKY类转录因子。自 序列2的氨基末端第172-178位氨基酸残基是保守的WRKYGQK结构，自序列2的氨基 末端第192-197位氨基酸残基为一个锌指结构。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述结构 域外进行取代和/或缺失和/或添加。所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对干旱和/或盐胁迫的耐逆件。为了使(a)中的GmWRKY54便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l.标签的序列<table>table see original document page 4</column></row><table>上述(b)中的GmWRKY54可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述(b)中的GmWRKY54的编码基因可通过将序列表中序列l自5'端第1至 972位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，禾Q/或进行一个或 几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列 得到。上述植物耐逆性相关蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的咖A序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。 上述严格条件可为在6XSSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65T下杂交，然后用2XSSC， 0. 1% SDS和1XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由972个脱氧核糖核苷酸组成，自5'末端的第1至972位脱 氧核糖核苷酸为fi3股ATW的开放阅读框(Open Reading Frame, 0RF)，自5，端的第 1至3位脱氧核糖核苷酸为fe 股^ :W的起始密码子ATG，自5，端的第970至972位脱 氧核糖核苷酸为"/^ATW的终止密码子TAG。"股ATW的表达受干甲.、盐和低温胁 迫的诱导。含有^ M^T54基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本专利技术的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有6iz 股^T54基因的重组表达载体。 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它 参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到raRNA 前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基 因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用fe^yMT54构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一 种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、玉米的泛 素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使 用本专利技术的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强 子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码 序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的 来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区 域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS 基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标 记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考 虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体具体可为在pBin438的5a/rfH和A^M位点间插入自序列表中 序列1的自5'末端的第1-972位脱氧核苷酸得到的pBin438-fe7/^AT^/。本专利技术的另 一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。本专利技术所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有fe^ AT(W基因的重 组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的大豆 TOKY家族转录因子GmWRKY54的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物 逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通 过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌 介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转 化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如大豆、拟南芥、水稻、 小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。实验证明，本专利技术的耐逆性相关蛋白及其编码基因能显著提高植物的耐盐性和耐 旱性。本专利技术的耐逆性相关蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非 生物胁迫如耐干旱和/或耐盐植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与植物耐逆性相关的由序列２衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈受宜，张劲松，周绮云，田爱国，何锶洁，杜保兴，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]