一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法技术

本发明专利技术涉及微生物固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃（ＰＡＨｓ）污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，按照重量５－２０％的比例将培养１２～１４ｈ的种子液与凝胶液混匀，在２５－４０℃和ｐＨ自然条件下，通过直径为１－４．００ｍｍ的制粒器，按照２０～３０滴／ｍｉｎ的流滴速度制得固定化颗粒，颗粒经１０～１８ｈ化学交联，然后在固定剂中静置加固２３～５８ｈ，最后以无菌水浸泡２４－７２ｈ，冲洗净残留药液后，增殖培养，备用；凝胶液质量百分配比为：海藻酸钠（Ｎａ.Ａｌｇ）２～３％，（１５０目）活性炭、红砖粉、泥炭土和／或粉煤灰０．３～０．６％，余量为水。本发明专利技术可使固定化颗粒的机械强度、弹性和缓释性能大大提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃(PAHs) 污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其是以海藻酸钠(Na Alg)为主要 载体材料，以泥炭土、红砖粉、粉煤灰等为辅助载体的包埋固定化微生物 工艺，可使固定化颗粒的机械强度、弹性和缓释性能大大提高。
技术介绍
采用传统的游离微生物技术修复受PAHs污染的土壤时存在一些缺陷， 如单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与土著菌竟争处于劣势、 抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感，加入到修复现场环境中的微生物可 能由于竟争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入，使得 不能很好的应用于原位污染土壤修复。而固定化微生物技术有望克服这些 缺点和弊端。固定化微生物技术UM)是利用化学或物理的手段，将游离的微生物 定位于限定的空间区域使其保持活性并能反复使用的一种技术。固定化方 法很多，由于包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都较高， 且应用灵活，是最为实用方便的固定化方法。包埋固定化是使微生物包埋在半透明的聚合物或膜内，或使微生物细 胞扩散进入多孔性的载体内部，小分子底物及代谢物可自由出入这些多孔 或凝胶膜，而微生物细胞却不能移动。尽管包埋固定化法已经广泛应用于 修复污染的流体介质，但在修复污染的非流体介质中应用该技术还未见成 功的实例。主要原因 一方面是因为非流体介质本身所具有的复杂性和特 殊性给该技术提出了许多不同于在流体介质中应用该技术时所面临的科学 问题，如固定化微生物颗粒的载体如何选择，如何克服在非流体介质中固 定化颗粒的不可回收性，如何克服污染物浓度的非均质性对固定化颗粒造 成的冲击；如果提高固定化颗粒的机械强度以抵抗环境胁迫造成的物理损 伤；另一方面是包埋法本身存在的缺陷，如颗粒的扩散传质性能差、空 隙不均匀、抗温度变化和酸碱度变化能力弱等。此外，传统的采用Na.Alg 固定化方法常常对应单一菌种，缺乏广谱适应性，对其他属菌株的固定不 利。耐用廉价的微生物固定化载体或包埋材料的研究和开发已成为进一歩 降低处理成本、促进技术推广应用的关键。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提出一种用于修复多环芳烃污染土壤的包 埋固定化载体配方及其工艺。本专利技术以海藻酸钠(Na .Alg)为主体载体材料，以活性炭、泥炭土、红砖粉、粉煤灰等材料为辅助载体，改进了传统的Na Alg包埋固定化工艺，使固定化条件更加简化和温和，提高了固定化颗粒的多种技术指标(性能更加优良)，并可对多种不同属微生物进行 固定化。将制得的固定化微生物应用于多环芳烃污染土壤的修复，结果表 明按照该配方制得的固定化生物产品机械强度高，对高分子量多环芳烃 污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为，按照重量5-20%的比例将培养12~14 h的种子液与凝胶液混句，在 25-40。C和pH自然条件下，通过直径为1-4.00 mm的制粒器，按照20~30 滴/min的流滴速度制得固定化颗粒，颗粒经10-18h化学交联，然后在固 定剂中静置加固23~58h，最后以无菌水浸泡24-72h，冲洗净残留药液后， 增殖培养，备用；凝胶液质量百分配比为海藻酸钠(Na Alg) 2~3%， (150目)活 性炭、红砖粉、泥炭土和/或粉煤灰0. 3~0.6%,余量为水。凝胶液配制过程为以所需自来水重量的20%浸润Na 'Alg凝胶剂12 ~ 20h, 100-ll(TC高温加热，完全溶解后冷却到35~45°C,再向凝胶液中添 加定量辅助载体，定容，使用前于IIO 。C下湿热灭菌30min，冷却到35~ 45°C，备用。所述交联剂质量百分配比为质量百分比为4%的CaCV溶液，pH值自 然或4。/。CaCl2-饱和硼酸溶液，pH值自然；加固剂质量百分配比为a.壳聚糖1.0y。水溶液，先用微量浓HC1溶解 后再加水定容，pH自然；b. 0. 6mol/L乙二胺水溶液，pH自然；或c. 4 。/。PVA水溶液，pH自然。增殖培养过程为，将制备的固定化颗粒再无菌条件下按照20~25%的 质量浓度加入增殖培养基中，控制温度在28-3(TC,摇床转速130rpm 150rpm,培养时间24h,之后更换培养基，共3次培养，备用。 细菌的菌体培养基为基础培养基牛肉膏O. 3%，蛋白胨1.0%, NaClO. 5%, 1.5~2. 0%琼脂， pH 7.0-7.2;种子培养基葡萄糖1.25%，牛肉膏O. 25%， NH萬O. 1%, MgS04 7H20 0. 02%， KC1 0. 02%, pH 7. 0~ 7, 2;增殖培养基葡萄糖4.0°/。，酵母膏0.3°/。， KH2PO4 0. 05%, MgS04 7H20 0.025%,(冊4)2线0,2%， pH 7.0-7.2。本专利技术具有如下优点1、通过优化Na 'Alg凝胶液配方各组分的含量，并利用交联和2次加 固等技术措施，制备的固定化颗粒微观结构均匀，制备的固定化颗粒为微 生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竟争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；孔隙率超过90%,提高了固定化效率扩散传质性能优异，为微生物提供了良好的生活环境。2、 通过向凝胶液中添加泥炭土、粉煤灰、红砖粉等辅助材料，使得固定化颗粒机械强度大为提高，最高可达44.23 kg/cm2,颗粒弹性优良，传 质性提高，材料的保温性能使得微生物在低温仍能保持很好的活性。此外， 泥炭土主要组分是木质素和纤维素，具有多孔结构，为微生物提供优良的 微环境，有利的屏蔽了外界土著菌的干扰，使固定化微生物很好的发挥对 多环芳烃降解作用，高分子量多环芳烃一般以共代谢的方式被降解，泥炭 土组分中的木质素和纤维素还可为微生物提供初级共代谢底物，诱导微生 物产生降解多环芳烃所必需的酶类，从而实现对高分子量多环芳烃的共代 谢降解。3、 固定化颗粒对环境的耐性得到显著增强，固定化细菌适应更低的环 境温度，在5 35'C范围内均能保持较好的活性，固定化细菌对pH变化呈 惰性，在pH二5 8范围内，固定化细菌的活性没有发生明显的改变。4、 固定化颗粒中的Na -Alg不发生自溶解现象，连续使用365天增殖 再生后，细菌活性恢复原始状态。5、 该载体及其固定化工艺可用于芽孢杆菌属(&ciJius sp.)、动胶 杆菌属(Zoog/oea sp.)、微球菌(Micrococcus sp.)等多菌种微生物的固定化，具有一定的广谱适用性。6、 固定化细菌对受芘(PYR)或苯并芘(BaP)等高分子量多环芳 烃污染土壤的修复中具有明显的修复效果，在投粒比为8% ~20%、修复时 间为42d的条件下，土壤中PYR去除率最高可达50. 6%，而对BaP的去除率 为41. 3%,较游离菌提高20%。7、 本专利技术所用载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好， 无毒，不会造成土壤的二次污染。具体实施方案下面通过实施例对本专利技术作进 一 步详细说明。 实施例1(比较例)(1) 细菌斜面培养在牛肉膏蛋白栋基础培养基(O. 3°/。牛肉膏,1. 0%蛋白栋,0. 5%NaCl， 1. 5 ~ 2. 0%本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法，其特征在于：按照重量５－２０％的比例将培养１２～１４ｈ的种子液与凝胶液混匀，在２５－４０℃和ｐＨ自然条件下，通过直径为１－４．００ｍｍ的制粒器，按照２０～３０滴／ｍｉｎ的流滴速度制得固定化颗粒，颗粒经１０～１８ｈ化学交联，然后在固定剂中静置加固２３～５８ｈ，最后以无菌水浸泡２４－７２ｈ，冲洗净残留药液后，增殖培养，备用；凝胶液质量百分配比为：海藻酸钠（Ｎａ.Ａｌｇ）２～３％，（１５０目）活性炭、红砖粉、泥炭土和／或粉煤灰０．３～０．６％，余量为水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏丹，李培军，鞠京丽，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]