一种快速建立ＤＳＥ与植物共生培养体系的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种快速建立ＤＳＥ与植物共生培养体系的方法及其应用，具体为快速建立深色有隔内生真菌与植物共生培养体系的方法及其应用，属于应用微生物学、植物营养和生态学领域。本发明专利技术基于ＤＳＥ碳源利用广且为好氧微生物这一生物学特性，选择透气性好的河沙为固体基质，添加经改进的ＭＳ培养基为营养液，满足了ＤＳＥ－植物共生体系建立早期的营养生长需求。本发明专利技术以植物幼苗、ＤＳＥ为材料。通过在无菌培养基上接种ＤＳＥ和植物幼苗，使其建立共生关系。本发明专利技术的方法具有ＤＳＥ与植物共生培养体系建立时间短、效率高等优点，可用于ＤＳＥ与植物的相互关系研究、ＤＳＥ形态学方面的研究，疑似ＤＳＥ菌株初步检测以及ＤＳＥ接种的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速建立DSE与植物共生培养体系的方法及其应用，具体为快 速建立深色有隔内生真菌与植物共生培养体系的方法及其应用，属于应用微生物学、 植物营养和生态学领域。
技术介绍
深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes， DSE)并不是一个科学的分类单元， 而是泛指一群定居于植物根内的小型土壤真菌，这类真菌的一般特征是菌丝颜色较 深、有明显的横隔，且广泛地存在于健康植物根表皮、皮层甚至维管束组织的细胞 内或细胞间隙，但不会在根组织内形成病原菌所引起的病理学特征。目前已报道600 多种植物的根系上均有DSE定殖，其分布遍及热带以及南北极和高山等多种生境。 关于DSE的研究从上世纪20年代已有报道，早年曾把这类真菌在植物根系上的定居 称为"假菌根(Pseudomycorrhiza)"、"类丝核菌(Rhizoctonia-like)"等，80年代后， 为便于交流，DSE逐渐成为研究人员通用的名词。近年来，越来越多的研究表明DSE 与宿主植物的关系正如丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi, AMF)与其宿 主植物一样，是一种共生关系。随着DSE与植物关系方面研究的深入，更多的研究需要在无菌条件下进行，或 需要获得无杂菌污染的DSE菌根化植物幼苗。然而，现行的共生培养方法主要借助 丛枝菌根真菌研究建立的技术，大多在开放条件下进行盆栽接种，或以腐殖土、琼 脂或麦麸等为培养基质在无菌条件下对组培苗进行接种。以上两种方法共同的缺点 是易遭杂菌污染，DSE生长缓慢，共生培养体系建立时间长、效率低等。经文献检索，未发现与本
技术实现思路
相同文献的公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有研究方法的不足，通过专利技术一种快速建立DSE与 植物共生培养体系方法，快速获得DSE—宿主植物高效的共生体，促进DSE和宿主植物间互作研究开发工作。为了达到上述目的，本专利技术基于DSE碳源利用广且为好氧微生物这一生物学特 性，选择透气性好的河沙为培养基质，添加经改进的MS培养基为营养液，满足了 DSE-植物共生体系建立早期的营养生长需求。经本专利技术所建立的培养体系于 OLYPUS-BX51显微镜下镜检观察，根据DSE解剖学特征并判断二者建立共生培养 体系的情况。本专利技术所提供的一种快速建立DSE与植物共生培养体系的方法，主要是以植物 幼苗、DSE为材料。通过在无菌培养基上接种DSE和植物幼苗，使其建立共生关系， 具体步骤如下(1) .DSE的活化、培养将冷冻保藏的试管斜面上的DSE菌株活化后，接种到 PDA培养基的平皿中，于28'C恒温培养2周，用打孔器沿菌落边缘打菌片若干；(2) .植物无菌苗的培养植物种子用75%乙醇和10%次氯酸钠表面消毒，消毒 时间视种子大小而定，消毒后的植物种子用无菌水漂洗3次，接种到蔗糖15 g/L， 琼脂8 g/L的蔗糖琼脂培养基平皿中，在25 'C温度下恒温培养，待种子萌发形成幼 苗时，挑选无污染生长一致的幼苗备用；无菌苗也可以通过组织培养方法获得。(3) . DSE和植物共体系的建立a. 共生培养基的制备DSE和植物二者共生培养基质为改进的MS培养基和河 沙，河沙经20目和140目筛子湿筛，收集140目筛面的河沙颗粒烘干待用；改进的 MS培养基为MS培养基的无机成分加20 g/L蔗糖；河沙与改进的MS培养基按 w/wlO: 3混合，放入玻璃器皿灭菌后备用；b. 植物幼苗和DSE的接种DSE和植物幼苗同时接入共生培养基，每个玻璃器 皿中接入幼苗2棵，DSE接种量为每棵植物幼苗2个02mm圆形菌片，接种时把菌 片打碎与培养基混匀，用培养基把幼苗根部埋好，再用无菌的玻璃纸或PVA膜或 PTFE膜封口；(4) .共生体系的建立接种后，在温度15—25 °C，光照10小时，光照强度1000 一8000 Lux的条件下培养20天；(5).共生培养体系的检测20天后，将植物从玻璃器皿中取出，用水洗净根部， 放入试管，添加10。/。KOH5ml，于9(TC水浴锅中解离2小时，经酸性品红染色、脱 色、制片过程后，于0LYPUS-BX51显微镜下镜检观察DSE的定殖情况，当部分根段看到DSE的典型特征结构-微菌核(Microsclerotia)时，表明DSE—植物共生体 系建立。本专利技术的方法作为DSE与植物的相互关系研究、DSE形态学方面的研究，疑似 DSE菌株初步检测以及DSE接种的应用。本专利技术的方法具有DSE与植物共生培养体系建立时间短、效率高等优点，可用 于DSE与植物的相互关系研究、DSE形态学方面的研究，疑似DSE菌株初步检测 以及DSE接种的应用。具体实施例方式'基于DSE真菌在改进的MS培养基生长良好这一生物学特性，利用以上方法建 立起DSE—宿主植物培养体系，经碱解离一酸性品红染色法，于OLYPUS-BX51显 微镜下镜检观察并初步判断DSE—植物共生体系建立效果。以下是本专利技术的实施例， 但本专利技术的内容并不局限于此，同样适用于疑似DSE菌株初步检测等。实施例l:瓶梗霉属(/Vi/fl/o;p^ra印.)DSE—玉米的共生体系培养1. 尸/u'a/op/wra s/ .菌株活化、培养从冷冻保藏的试管斜面上将瓶梗霉属YIO、 H122bl、 H112a、 H122b的四个菌株 活化后，分别接种到含PDA培养基的平皿中，于28'C恒温黑暗培养2周。用无菌 打孔器沿菌落边缘打若干菌片备用。2. 玉米无菌苗的培养将玉米种子依次使用75%乙醇5 min， 10%次氯酸钠10 min表面消毒，无菌水漂 洗3次，每次3min，然后接种到蔗糖琼脂培养基(蔗糖15 g/L，琼脂8 g/L)平皿中，每 皿5粒。25'C恒温培养72小时，挑选无污染生长一致的幼苗备用。3. DSE和玉米共体系的建立 (1)共生培养基的制备DSE和玉米共生培养基质为改进的MS培养基和河沙。河沙经20目和140目筛 子湿筛，去除多余的土壤颗粒，收集140目筛面的河沙颗粒烘干待用。改进的MS 培养基为MS培养基的无机成分加20 g/L蔗糖。按100 g河沙添加30 ml改进的MS 培养基于①60mmx200mm规格的平底试管中，于121 'C灭菌30 min后备用。(2)玉米幼苗和DSE的接种在无菌条件下，将YIO、 H122bl、 H112a、 H122b四株DSE分别与玉米幼苗同 时接入试管中，每支试管接入玉米幼苗2棵，DSE接种量为每棵玉米幼苗2个02 mm 圆形菌片。接种时，把菌片打碎与培养基混匀。用培养基把玉米幼苗根部埋好，用 无菌玻璃纸封口。空白对照接入玉米幼苗和相同量的无菌PDA培养基圆片。YIO、 H122bl、 H112a、 H122b、空白对照五种处理分别做重复三次。(3) 共生体系的建立接种后，在培养温度15—25'C ，光照10小时/天，光照强度2000 Lux的条件 下培养20天。除空白对照外，所有处理在1周后可以看到培养基表面布满菌丝，颜 色变深；2周后可以看到玻璃器皿底部部分根的颜色变深。(4) 共生体系的检测20天后，将玉米从试管中取出，将根部用水洗净，放入含有10%KOH 5 ml的试 管中，于9(TC水浴锅中解离2小时，经常规的酸性品红染色、脱色、制片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速建立ＤＳＥ与植物共生培养体系的方法，以植物幼苗、ＤＳＥ为材料，通过在无菌培养基上接种ＤＳＥ和植物幼苗，使其建立共生关系，其特征在于本专利技术方法的具体步骤如下：（１）．ＤＳＥ的活化、培养：将冷冻保藏的试管斜面上的ＤＳＥ菌株活化后，接种到ＰＤＡ培养基的平皿中，于２８℃恒温培养２周，用打孔器沿菌落边缘打菌片若干；（２）．植物无菌苗的培养：植物种子用７５％乙醇和１０％次氯酸钠表面消毒，消毒时间视种子大小而定，消毒后的植物种子用无菌水漂洗３次，接种到蔗糖１５ｇ／Ｌ，琼脂８ｇ／Ｌ的蔗糖琼脂培养基平皿中，在２５℃温度下恒温培养，待种子萌发形成幼苗时，挑选无污染生长一致的幼苗备用；（３）．ＤＳＥ和植物共体系的建立：ａ．共生培养基的制备：ＤＳＥ和植物二者共生培养基质为改进的ＭＳ培养基和河沙，河沙经２０目和１４０目筛子湿筛，收集１４０目筛面的河沙颗粒烘干待用；改进的ＭＳ培养基为ＭＳ培养基的无机成分加２０ｇ／Ｌ蔗糖；河沙与改进的ＭＳ培养基按ｗ／ｗ１０∶３混合，放入玻璃器皿灭菌后备用；ｂ．植物幼苗和ＤＳＥ的接种：ＤＳＥ和植物幼苗同时接入共生培养基，每个玻璃器皿中接入幼苗２棵，ＤＳＥ接种量为每棵植物幼苗２个Φ２ｍｍ圆形菌片，接种时把菌片打碎与培养基混匀，用培养基把幼苗根部埋好，再用无菌的玻璃纸或ＰＶＡ膜或ＰＴＦＥ膜封口；（４）．共生体系的建立：接种后，在温度１５－２５℃，光照１０小时，光照强度１０００－８０００Ｌｕｘ的条件下培养２０天；（５）．共生培养体系的检测：２０天后，将植物从玻璃器皿中取出，用水洗净根部，放入试管，添加１０％ＫＯＨ５ｍｌ，于９０℃水浴锅中解离２小时，经酸性品红染色、脱色、制片过程后，于ＯＬＹＰＵＳ－ＢＸ５１显微镜下镜检观察ＤＳＥ的定殖情况，当部分根段看到ＤＳＥ的典型特征结构－微菌核时，表明ＤＳＥ－植物共生体系建立。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘茂军，李涛，赵之伟，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]