鉴定人早期癌症、癌症发展和复发标志物的方法技术

本发明专利技术描述了一种鉴定癌症恶性程度相关分泌蛋白的方法。先利用含有可插入荧光蛋白基因的载体捕获蛋白质进行鉴定。通过荧光鉴定此分泌蛋白。分离到此分泌蛋白即可鉴定肿瘤的具体恶性程度，从面确定它们可否用作癌症发展的标志物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了鉴定癌症分泌的标志蛋白的方法。具体说，本专利技术采用的基 因捕获技术能检测基因表达的变化。
技术介绍
癌症死亡率主要由于诊断太晚所致，癌症发展到晚期时现有的治疗方法已 无效。虽然采用质谱和其它技术的蛋白质组学能够特征鉴定血清、血浆和尿中的蛋白质，但对大多数癌症类型而言，仍然缺少有用的早期标志物(Rai等，」"". 7V7爿c^/. Scz.. (2004) 1022:286-294; Diamandis ， A^/. Omcer (2004) 96:353-356)。组织学曾采用抗肿瘤细胞提取物的单克隆抗体来鉴定候选的肿瘤标志物 (Fidler， Ca"cer i a ewr/2 (1978) 38:2651-2660)。对这些候选物的筛选和评价已 成为鉴定新型肿瘤标志物的传统方法。然而，这种技术有局限性，在评价大量 候选标志物时劳动强度高而且耗时。对特定癌症类型的灵敏和特异性标志物的鉴定也很困难。对大多数癌症类 型的诊断、预后、分期、复发和检测残留的很少癌症的标志物鉴定仍有困难。目前用于分析血清的SELDI-TOF质谱技术无法检测到浓度低于1 pg/mL 的任何血清组分(Lai等，/Voc A/a仏XcW. C/iX4 (2002) 99:3651:3656)。但此 浓度范围比循环系统中已知肿瘤标志物的浓度高约1000倍(表l)(Lai，同上)表l<table>table see original document page 4</column></row><table>参考文献Diamandis， 同上。基因-捕获载体可标记内源基因，使得能够检测基因表达的变化。标记基 因使得能够研究相应基因的特异性启动子和功能。然而，基因-捕获载体(大部 分是质粒或逆转录病毒的载体)的局限性是效率低、表达时期短暂或限于分裂 细胞。近年来开发的基于HIV-1的慢病毒载体克服了这些障碍，已逐渐提高了 其在体外基因递送中的应用。这些载体能导致在体内中枢神经系统(CNS)、造 血系统、视网膜、肌肉、肝脏和胰岛的细胞中长期的基因表达(Lai，同上)。HIV-1慢病毒载体可整合到分裂和未分裂的细胞基因组中，而稳定表达转 基因。已经开发了两种基于HIV-1的慢病毒载体衍生物pZR-l和pZR-2，用于 哺乳动物细胞的体外和体内基因捕获(Lai，同上)。这些慢病毒基因-捕获载体 所含的报道基因或是P-内酰胺酶或是绿色荧光蛋白(GFP)，插入在3'长末端重 复序列的U3区中。采用方便的感染技术很容易将这两种捕获载体整合到宿主 基因组中，而导致GFP或P-内酰胺酶表达。这种技术有助于快速富集和克隆 捕获的细胞。这种报道基因可由上游细胞特异性启动子驱动(Lai，同上)。
技术实现思路
本专利技术方法利用基因捕获技术来鉴定作为各种程度人类恶性癌症，如早期 癌症、癌症发展和复发标志物的分泌蛋白。在一个代表性实施方式中，用上述 GFP-基因-捕获载体转染恶性人癌(细胞)的初始变体使之向正常状态回复 (Jiang等，/Voc. Awoc./or Ca"cerT ay. (2004) 45:937)。鉴定表达GFP的细 胞系，测定它们是否分泌GFP-捕获蛋白。将分泌GFP-连接蛋白的细胞克隆植 入小鼠中，测定血清中是否分泌了 GFP-连接蛋白。在体内评估这类克隆，鉴 定这种非恶性变体的特异性连接GFP的分泌蛋白。后续实验利用动物使该非 恶性人癌变体再次回复成各种阶段恶性细胞来鉴定(标志)癌症发展的特异性 分泌GFP的连接变体。对恶性程度低的人癌细胞变体进行平行体外实验(Jiang， 同上)，以比较体内和体外向恶性细胞发展的人细胞分泌GFP的连接蛋白。在一方面，本文提供了鉴定癌症分泌的标志蛋白的方法，该方法包括a) 用含有报道基因的HIV-1慢病毒-基因-捕获载体转染恶性程度不同、已经向非 恶性状态回复的多种人癌细胞；b)鉴定能在体外分泌报道物连接蛋白的含有表 达报道物的细胞系；c)将已鉴定到报道物表达细胞系各克隆植入动物中；d)鉴 定在血清中分泌报道物连接蛋白的植入的报道物表达细胞系克隆；和e)鉴定步骤d)中恶性程度从低到高各阶段人癌细胞特异性分泌的报道物连接蛋白；其 中，鉴定到的蛋白质是各癌症阶段的标志。在一实施方式中，所述方法还包括: f)鉴定非恶性人癌细胞再次回复成各阶段恶性细胞的癌症发展的特异性分泌的 报道物连接蛋白；其中，鉴定到的蛋白质是癌症发展和复发的标志。该方法还 可包括g)比较向恶性发展的恶性程度低的人癌细胞中体外和体内分泌的报道 物连接蛋白。在一些实施方式中，所述报道物是GFP，步骤b)还包括bl)用RFP转化向 正常状态回复的转染癌细胞；b2)分离和克隆GFP+细胞；b3)培养GFP+克隆； b4)鉴定GFP+荧光克隆；和b5)从鉴定到的荧光克隆中鉴定分泌GFP-蛋白的细 胞。该方法在步骤d)之后还可包括，制备体内分泌报道物-或GFP-蛋白的细胞 文库。本专利技术方法中的报道基因可以是GFP或p-内酰胺酶。含有报道基因的 HIV-1慢病毒基因-捕获载体可以是HIV-1慢病毒-GFP-捕获载体如pZR-l或 pZR-2。植入的克隆可选自前列腺癌、睾丸癌、肺癌、肝细胞瘤、绒毛膜癌、 乳腺癌或结肠癌细胞。在另一方面，本文提供了用本专利技术方法鉴定的蛋白质。在还有一方面，本文提供了包含各种恶性程度的人癌细胞文库，其中所述 细胞含有随机捕获的基因，各自含有报道基因。在一些实施方式中，所述报道 基因表达绿色荧光蛋白(GFP)。考虑到，人癌细胞亚组含有能编码分泌蛋白的 报道物捕获基因。在一实施方式中，该报道物捕获基因能在体外表达分泌的蛋 白质。在一些实施方式中，该报道物捕获基因能表达体内分泌的蛋白质。当癌 细胞具有特定的恶性程度时，该报道物捕获基因能表达体外或体内分泌的蛋白 质。有时，癌细胞具有的恶性程度能够侵入(组织)或转移。在这类细胞中， 报道物捕获基因有时能表达体外和体内分泌的蛋白质，而可在移植有表达该报 道物捕获基因的细胞的啮齿动物血清中可以检测到。在一方面，本文提供了能够表达用本文所述任何方法鉴定到的癌症发展标志蛋白的分离基因的文库，其中在肿瘤发展的特定步骤中所述基因不含报道基 因或基因-捕获载体。附图的简要说明附图说明图1是说明本专利技术实施方式的实验流程图。图2描述了 Lai(同上)所述的HIV-1慢病毒基因-捕获载体系统的组件。(J) 载体构建物。(Z)基因-捕获载体含有报道基因GFP(ZR-2)，后接剪接接受位点。 0'0HIV-1慢病毒对照载体BLAK， (3-内酰胺酶编码基因；SA，剪接接受位点。 (5)辅助(包装)构建物。(C)编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的包膜构建物 (Lai,同上)。实施本专利技术的方式本专利技术方法利用了含有报道基因的HIV-1慢病毒基因-捕获载体，将其转 染到恶性程度不同的人癌细胞中。在一方面，鉴定已向正常状态回复的因而可 认为是"非恶性"的人癌细胞的特异性蛋白。随着细胞从此种非恶性阶段向恶性 阶段轻微发展，可转染恶性程度低的人癌细胞。这种再次回复成各种恶性阶段 的非恶性人癌细胞适合于鉴定癌症的发展和复发。因此，术语"不同恶性程度" 指本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定癌症分泌的标志蛋白的方法，所述方法包括：　　　　ａ）用含有报道基因的ＨＩＶ－１慢病毒－基因－捕获载体转染恶性程度不同、已经向非恶性状态回复的多种人癌细胞；　　　　ｂ）鉴定能在体外分泌报道物连接蛋白的报道物表达细胞系；　　　　ｃ）将已鉴定到的各报道物表达细胞系的克隆植入动物中；　　　　ｄ）鉴定在血清中分泌报道物连接蛋白的植入的报道物表达细胞系克隆；和　　　　ｅ）鉴定步骤ｄ）中恶性程度从低到高的各阶段的人癌细胞特异性分泌的报道物连接蛋白；　　　　其中，鉴定到的蛋白质是各癌症阶段的标志。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐明旭，Y谭，L科佩洛维奇，
申请(专利权)人：抗癌股份有限公司，以局长为代表的美国政府，卫生署和人类服务部，
类型：发明
国别省市：US[美国]