本发明专利技术公开了一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得动物膜蛋白的方法，是通过重组杆状病毒ＢａｃｍｉｄＣＭＶ－Ｇ－ＨＡ感染动物宿主细胞后增殖，在病毒出芽时带走宿主细胞膜成分而形成自身的囊膜，将病毒粒子分离出，再获得囊膜成分，反复冻融，获得膜蛋白。本发明专利技术的有益之处在于：提供了一种新的膜蛋白分离纯化的技术方法，通过囊膜病毒感染动物宿主细胞，病毒携带的ＨＡ融合基因表达后将会定位于宿主的细胞膜上，以ＨＡ为膜蛋白上的一个标志，有ＨＡ活性则表明有细胞膜成分存在，有助于发现药物蛋白作用的靶点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一 种利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法。
技术介绍
生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细 胞与基质之间的连接等等。膜蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点。膜蛋 白是许多药物的作用靶位点，研究膜蛋白不仅有利于低丰度蛋白的研究，更为 药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而，膜蛋白的分离是膜蛋白 研究的"瓶颈"，研究蛋白的高效方法双向电泳技术也不适合膜蛋白的研究。杆状病毒出芽时能带走宿主细胞部分膜成分，但杆状病毒具有限制性，只能感染昆虫细胞。然而，1995年，Hofmann等研究发现在杆状病毒DNA中插入 C匿(human cytomegalovirus immediate-early region)后，杆状病毒可以在人 肝细胞中表达。1997年，Barsoum等研究报道，在杆状病毒DNA中插入VSV-G (vesicular stomatitis virus G protein)能扩大宿主范围并增力口转染率。
技术实现思路
针对现有技术的不足之处，本专利技术提供一种膜蛋白分离与纯化新的技术方法。本专利技术的，是通过 重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA感染动物宿主细胞后增殖，在病毒出芽时带走宿 主细胞膜成分而形成自身的囊膜，将病毒粒子分离出，再获得囊膜成分，反复 冻融，获得膜蛋白。利用囊膜病毒出芽特性高效获得膜蛋白的方法，具体包括以下步骤 (1 )重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA以5M0I感染动物宿主细胞，37°C、 5 %(:02条件下培养3 4天，用PBS冲洗细胞，收获细胞；(2 ) 1000rpm离心，去除上述步骤(1 )所得细胞的碎片，上清液进行超 速离心，35000rpm， 30 60min，收集病毒粒子，沉淀的病毒粒子用PBS缓冲液 重悬溶解，用于蔗糖密度梯度超速离心，35000rpm离心3小时后，按峰收集样口(3)将上述步骤(2)的密度梯度收集的有活性的病毒粒子样品在液氮 和37"C之间反复冻融3 5次，使囊膜破裂，12000rpm，离心20 60min，使大 片的囊膜沉淀下来，得到膜蛋白。所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法在pFastBac 载体中插入 CMV-VSV-G序列和HA融合基因序列后，利用Bac-to-Bac 系统获得BacmidCMV-G-HA。所述重组杆状病毒BacmidCMV-G-Ha的构建方法包括以下步骤(1) 融合基因HA与质粒pFastBacTM同时进行EcoR I和Xho I双酶切，在 T4连接酶的作用下使HA融合基因插入到pFastBacTM质粒中，转化到感受态细 胞E.coli DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切测序鉴定出正确连接的质粒 pFastBac-HA;(2) 通过pHCMV-VSV-G的序列设计一对PCR引物，扩增出CMV-VSV-G的序 列，含BamH I位点的上游弓l物atggatccgagcttggcccattgcatac，含EcoR I 位点的下游引物gcgaattcgacggatccttatcactttc， PCR反应结束后，电泳，纯 化回收反应产物；(3) 步骤(2)纯化后的PCR产物与步骤(1)所得质粒pFastBac-HA分别 进行BamH I和EcoR I双酶切，在T4连接酶的作用下使PCR产物克隆至质粒 pFastBac-HA中，转化至感受态细胞DH5a中，挑取单菌落，提取质粒，酶切和 测序鉴定正确插入的重组质粒PFastBacCMV-G-HA;(4) 根据Bac-to-Bac 系统，取5ul步骤(3)所得重组质粒 pFastBacCMV-G-HA转化到DH10BacTM感受态细胞中，平板于37'C培养24-48h后 挑取白色克隆，划线接种至平板上，过夜培养，证实是阳性克隆；第二天，挑 取单菌落接种于液体培养基中培养，获得重组质粒BacmidCMV-G-HA; (5)取重组质粒BacmidCMV-G-HA的DNA约5ul加入lOOul Sf-900 II SFM，取cellfectin 试剂加入到lOOul的Sf-900 II SFM，再将两者混匀，室 温放置15 30min， Sf9培养在含50个单位的青霉素和链霉素的SFM中，将细 胞转移到27。C至少放置lh，再用不含抗生素的SFM培养基洗涤两次后，加入上 述的DNA混合物，27。C培养5h，移去DNA混合物，加入含抗生素的SFM，于27 。C培养72h，收获细胞，获得重组杆状病毒BacmidCMV-G-HA。 所述的融合基因HA的构建包括以下步骤(1) 以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽基因，PCR所用的两种引物为Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，Psp2: 5， tgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgc 3，；(2) 以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域基因，PCR所用的两种引物为Ptml: 5， cgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaa 3' Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，；(3) 以禽流感病毒H5N1 HA基因序列为模板，扩增HA基因，PCR所用的两 种引物为Phal: 5， aaagaacgttactgttacac 3， Pha2: 5' atgcaaattctgcattgtaa 3';(4) 以gp64信号肽基因和HA基因为模板，利用PCR方法扩增出sp-HA融 合基因序列，PCR所用的两种引物为Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3， Pha2: 5， atgcaaattctgcattgtaa 3，(5) 以融合基因sp-HA与gp64跨膜域基因为模板，构建出HA融合基因， PCR所用的两种引物为Pspl: 5， gcgaattcatgctactagtaaatcag 3，Ptm2: 5， gtgagctcttactttccaagtcggttcatc 3，。步骤(4 )中所述的DH10BacTM感受态细胞含Bacmid质粒。步骤(4)中所述的平板含Bluo-gal、卡那霉素、庆大霉素、四环素、 IPTG。步骤(4)中所述的液体培养基含卡那霉素、庆大霉素、四环素。 步骤(5)中所述的含抗生素的SFM，所述的抗生素为青霉素和链霉素。本专利技术的有益之处在于本专利技术提供了一种新的膜蛋白分离纯化的技术方 法，通过囊膜病毒感染动物宿主细胞，病毒携带的HA融合基因表达后将会定位 于宿主的细胞膜上，以HA为膜蛋白上的一个标志，有HA活性则表明有细胞膜 成分存在。膜蛋白质的研究一直是蛋白质组学研究的瓶颈，本专利技术主要针对膜 蛋白，能促进膜蛋白组学研究的发展，有助于发现药物蛋白作用的耙点，促进 药物学、医学的发展。具体实施例方式本专利技术利用杆状病毒出芽并带走宿主细胞部分膜成分的特性，先分离出出 芽病毒(囊膜病毒)，再获本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用囊膜病毒出芽特性高效获得动物膜蛋白的方法，其特征在于：重组杆状病毒ＢａｃｍｉｄＣＭＶ－Ｇ－ＨＡ感染动物宿主细胞后增殖，在病毒出芽时带走宿主细胞膜成分而形成自身的囊膜，将病毒粒子分离出，再获得囊膜成分，反复冻融，获得膜蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，陈健，吕正兵，吴祥甫，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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