用于DNA介导基因沉默的组合物制造技术

提供了通过ＲＮＡ干扰介导基因沉默的ＤＮＡ组合物。ＤＮＡ组合物包括驱动编码中间体小干扰ＲＮＡ分子的核苷酸序列表达的ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子和ＲＮＡ聚合酶Ⅲ终止子。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
专利
本专利技术总体上涉及转录后基因沉默，特别是涉及DNA介导的通过RNA干扰进行的转录后基因沉默。背景信息去除一个基因的表达可以提供给研究者有关该基因功能的信息。在蛋白水平这可以通过运用特异性抑制剂抑制蛋白质功能而实现或者在RNA水平通过阻止mRNA翻译成蛋白质来完成。用于RNA水平抑制的传统方法包括反义寡核苷酸和核酶。这些抑制基因表达的方法也提供了对人类疾病的潜在治疗方法。新近在mRNA水平沉默基因表达的方法，称为RNA干扰或RNAi，已经成为较以前的技术而言非常有力的备选方法。它通过大量未知然而却比反义机制更加有效的机制起作用。双链RNA(“dsRNA”)参与这种转录后基因沉默，转录后基因沉默在植物和真菌中是天然存在的现象(Cogoni和Macino，Curr.Opin.Microbiol.6657-62.1999)。当导入蠕虫、苍蝇、或早期小鼠胚胎时，dsRNA可诱导降解与dsRNA的一条链具相同序列的mRNA的细胞反应(Fire，Trends Genet.9358-363，1999)。在一些系统中，少量dsRNA拷贝能诱导靶mRNA全面降解(Fire等，Nature 6669806-811，1998)。RNAi可与mRNA中几乎任何序列非常成功高效地作用(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-9747，2001)。RNAi作为基因功能研究工具非常有前途，如果能够将其成功地用于哺乳动物细胞或有机体，RNAi则是人类疾病的潜在治疗方式。RNAi在大多数哺乳动物系统中基本上是不成功的，这一状况直到最近由于与用于蠕虫和果蝇的dsRNA相似的dsRNA的导入，通过有PKR和干扰素参与的哺乳动物抗病毒系统诱导了基因表达的普遍阻断而得以改变(Caplen等，Gene 1-295-105.2000；Oates等，Devel.Biol.120-8.2000)。然而，通过使用一个短的21到23个核苷酸的dsRNA，Elbashir等和其他研究者的研究表明小的干扰RNA(siRNA)能够降低或敲低(knock-down)特异基因的表达，而不至于引起基因表达的普遍关闭(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-7.2001；Elbashir等，Nature 6836494-8.2001)。聚合酶III启动子的使用能够有效地在哺乳动物细胞内产生siRNA。例如，象U6启动子一样，同样是聚合酶III的III类启动子的H 1-RNA启动子已用于质粒载体中，以直接转录出一短的发夹RNA，随后该发夹RNA在细胞内被加工产生siRNA(Brummelkamp等，Science 296550-553.2002)。同样U6启动子也用于产生短的发夹RNA(Paddison等，Genes Devel.8948-958.2002；Paul等，Nat.Biotechnol.5505-508.2002；Sui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85515-20.2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-6052.2002)，或有意和反义siRNAs(Lee等，Nat.Biotechnol.5500-505，2002；Miyagishi和Taira，Nat.Biotechnol.5497-500，2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52，2002)。短的发夹RNAs(shRNAs)能够模拟天然存在的可能与RNAi相关的小RNA(micro-RNAs；miRNAs)。然而，当前有关设计和将此类人工shRNA加工成RNAi诱导者功能的资料仍然相互矛盾。例如，一篇报道发现发夹环的大小(如多于7个核苷酸)和序列非常重要(Brummelkamp等，见上文，2002)，而其他人采用较短的环(1，4或6个核苷酸)也成功了(Paddison等，见上文，2002；Paul等，见上文，2002；Sui等，见上文，2002；Yu等，见上文，2002)。基因沉默的效应在一些情况下依赖于发夹中有意链和反义链的次序和方向(Paddison等，见上文，2002)，但是在其他人看来是不重要的或不相干的(Paul等，见上文，2002)(Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52.2002)。所有上述的研究都利用了短的III类聚合酶III启动子和其简单的终止子产生了高拷贝数量的短转录物。尽管观察到了具有诱导非特异性表达关闭潜能的较长转录本，简单的天然终止子可能不足以在预期位置终止所有转录(Lee等，见上文，2002)。在用水动力学转染方法将合成的siRNA或从U6启动子转录的shRNA导入成年小鼠内后能够有效地使转基因或病毒基因沉默(McCaffrey等，Nature 41838-39，2002)。将长的或短的通过体外或体内转录分离的、在可溶性细胞提取物中加工得到的或化学合成的dsRNA分子导入细胞的方法具有严重的局限性。一个局限是分离的dsRNA所介导的基因沉默，也称作基因敲低，只是暂时的，因为由RNA分子所携带的遗传信息不能整合到宿主细胞的染色体上，所以dsRNA的效应只在有限次的细胞分裂过程中维持。另一个局限是RNA分子特别不稳定，易于被环境中大量存在的RNase降解。因此操作RNA分子需要格外小心。将RNA分子用于治疗目的是不切实际的。经修饰的RNA，如在核苷酸上加入保护基团或改变多核苷酸链的骨架能够提高稳定性，就象在许多反义研究中那样。然而，经修饰RNA分子的几种形式虽然较天然RNA相比能够对RNase的降解作用具有更强的抵抗性但会出现RNAi能力的减弱或丢失，而用DNA替换dsRNA中的一条链根本不能诱导产生RNAi(Parish等，Mol.Cell 51077-87.2000)。此外，制备RNA分子的费用很高并且方法繁琐而复杂。由于存在这些局限性，能够提供永久的导入细胞或生物体(如哺乳动物，例如小鼠或人)，和/或不依赖于使用RNA分子作为载体的用于基因沉默的材料和方法具有巨大的经济利益。另一方面，DNA分子比RNA分子更加稳定且成本效率更高。DNA分子可以被整合到宿主细胞基因组并且在宿主细胞内具有长期的效应。DNA分子相对容易合成和操作。专利技术概述本专利技术提供了用于靶基因表达抑制和利用DNA作为工具降解靶RNA的方法和组合物。这种方法是指“DNA介导的基因沉默”(“DMSG”“De-message”)。这样，本专利技术提供了通过对靶细胞(例如，预对其中特定RNA进行降解的细胞)用RNA干扰效应进行的诸如真核细胞或生物体内(包括哺乳动物细胞或有机体在内)基因特异的干扰。本专利技术提供了不必要在靶细胞外操作RNA分子而实现RNAi的好处。可以诱导RNAi用于短暂的基因敲低，还可以用于永久的基因敲低，因为编码RNAi的DNA分子可以插入到靶细胞内的染色体上。相应的，DMSG也可以用于产生遗传学上修饰的动物，它是通过将DMSG掺入生殖系统，从而能够提供根据设计组成型表达或使用诱导试剂诱导表达编码RNAi的下一代动物。这样，本专利技术的另一个优点是基因特异的沉默可以限定在一种或少数几本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）分子，其包含编码中间体小干扰核糖核酸（ＲＮＡ）分子（ｓｉＲＮＡ）的至少约１６个核苷酸的可表达模板核苷酸序列，所述分离的ＤＮＡ分子介导靶ＲＮＡ的ＲＮＡ干扰，所述中间体ｓｉＲＮＡ包含：ａ）含有与靶ＲＮＡ有意链 互补的至少约１５个核苷酸的５′部分和含有不与靶ＲＮＡ有意链互补的约１－５个核苷酸的３’端部分，其中该ｓｉＲＮＡ选择性地与靶ＲＮＡ有意链杂交；或ｂ）含有与靶ＲＮＡ反义链互补的至少约１５个核苷酸的５’部分和含有不与靶ＲＮＡ反义链互补的约 １－５个核苷酸的３’端部分，其中该ｓｉＲＮＡ选择性地与靶ＲＮＡ反义链杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继武，
申请(专利权)人：美国绿阳生物技术及医药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]