一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法及其应用和探针制备技术

本发明专利技术公开了一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法及其应用，检测步骤包括：①将容器内依次加入磷酸缓冲盐溶液、稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针溶液和银离子溶液；②分组并加入含不同浓度生物硫醇的标准溶液和含未知浓度生物硫醇的待测样品，③稀释混匀后温育；④测定各组溶液荧光强度的变化；⑤以标准溶液组加入的生物硫醇浓度为横轴，标准溶液荧光恢复程度为纵轴，绘制标准曲线；⑥通过待测样品的荧光恢复程度与所述标准曲线对比，判定样品的生物硫醇浓度。其利用NRPCNRs‑Ag

An unmarked biofluorescence fluorescence detection method based on rice leaf nitrogen doped carbon nanoribbons and its application and probe preparation

The invention discloses a rice leaf nitrogen doped carbon nano with unlabeled biological thiols fluorescence detection method and its application based on the detection method comprises the following steps: the container followed by adding phosphate buffered saline, rice leaf nitrogen doped carbon nano fluorescent probe solution and silver ion solution; the sample grouping and added standard solution with different concentrations of biological thiols and unknown biological thiols concentration, the dilution and mixing of incubation; the determination of the changes of the fluorescence intensity of the solution; the biological thiols concentration standard solution group added to the horizontal axis, the standard solution of fluorescence recovery degree for the vertical axis, draw standard curve; through the fluorescence of the sample recovery the degree and the standard curve comparison, determine the biological thiols concentration samples. The use of NRPCNRs Ag

【技术实现步骤摘要】
一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法及其应用和探针制备
本专利技术涉及微量检测领域，具体涉及一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法及其制备和应用。
技术介绍
生物硫醇类巯基化合物，通常包含半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)。由于这些分子在生物体中发挥重要的生理作用，目前已经引起越来越多科研工作者的关注。大量研究证明，生物体中巯基化合物的失衡与许多疾病密切相关。例如，人体中半胱氨酸的浓度过高会引起神经毒害，而半胱氨酸缺乏将会导致身体水肿、生长减慢、白细胞减少、头发脱落以及其他的身体机能紊乱疾病。同型半胱氨酸浓度升高也与许多疾病，如心血管疾病、骨质疏松症、老年痴呆症等密切相关。此外，如果人体中谷胱甘肽水平异常，将会抑制机体免疫系统功能、加速衰老，并与糖尿病、结核病、艾滋病等一些疾病相关。由于，通过检测如血浆、活细胞或尿等生物样品中这些化合物的水平，可以为临床上相关疾病的诊断提供诊断依据。因此，发展生物硫醇有效的检测方法具有非常重要的现实意义。目前，已经发展了许多方法用于生物硫醇的检测，包括高效液相色谱-质谱法、区带毛细管电泳法、电化学法、以及电感耦合等离子体-质谱法(简称ICP-MS)等。但是这些检测技术往往存在一些不可避免的缺点，例如仪器昂贵且笨重、操作程序复杂、测量时间长，并且对操作者的技能要求高，需要专门技术人员人操作等。为了克服上述涉及的主要问题，基于荧光探针检测生物硫醇的技术受到越来越多的关注，也得到了广泛的发展。然而，尽管这些检测技术对生物硫醇具有较高的选择性和灵敏度，但是这些方法往往涉及复杂并且昂贵的分子信标探针的修饰以及荧光团和荧光淬灭基团的标记，所以该类传感器往往耗时且需要繁琐的前处理过程。因此，亟需开发一种简单快速、灵敏度高、选择性好的荧光传感检测技术应用于生物硫醇的分析检测。
技术实现思路
针对上述现有技术的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法，利用NRPCNRs-Ag+的可逆络合，无须荧光标记，便能够在生物硫醇中实现荧光恢复并即时定量分析。提供一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法，检测步骤包括：①将容器内依次加入磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferedSaline，简称PBS)、稻叶状氮掺杂碳纳米带(简称NRPCNRs)荧光探针溶液和银离子溶液；②分组并加入含不同浓度生物硫醇的标准溶液和含未知浓度生物硫醇的待测样品，③稀释混匀后温育；④测定各组溶液荧光强度的变化；⑤以标准溶液组加入的生物硫醇浓度为横轴，标准溶液荧光恢复程度[(FL-FL0)]/FL0为纵轴，绘制标准曲线；⑥通过待测样品的荧光恢复程度与所述标准曲线对比，判定样品的生物硫醇浓度。优选的，在步骤①中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针与银离子的质量比为(2-3):1。优选的，在步骤③中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针浓度为10-25μg/ml，银离子浓度为70-90μM。优选的，在步骤④中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带的氮掺杂含量为(35-37)wt％。优选的，荧光激发波长为355nm、激发和发射狭缝宽均为3nm。生物硫醇包括半胱氨酸和谷胱甘肽中的至少一种，更优选的，所述待测样品为生物样品，含有血清和细胞中的至少一种。优选的，在步骤⑤和⑥中，绘制所述标准曲线及计算待测样品中生物硫醇含量的方法，采用标准加入法。一种稻状叶氮掺杂碳纳米带在生物硫醇检测中的应用，通过上述检测方法，结合NRPCNRs-Ag+对待测样品进行无标记荧光检测。优选的，荧光探针外形为稻叶状，粒径为100-120nm，N元素掺杂量(35-37)wt％，激发波长为355nm。进一步，所述稻状叶氮掺杂碳纳米带的荧光探针通过水热合成法制备，制备步骤包括：将1.1g尿酸(UricAcid)，25mL无水乙醇和25mL去离子水混合，在超声条件下混匀为悬浮液；将制备的25mL悬浮液转移到聚四氟乙烯高温反应釜中，并在180℃下保持4.5h；自然冷却至室温，用二氯甲烷萃取所得产物，并将萃取所得水相溶液冷藏5-10天，静置除去长度大于1μm的大尺寸NRPCNRs；然后，再将收集到的溶液于8000rpm离心15min，取上层亮黄色NRPCNRs水溶液，并将所得亮黄色溶液在4℃下储存备用。本专利技术所带来的综合效果：1、本专利技术采用简单快速的水热法合成水溶性好、分散均匀、具有荧光特性、荧光稳定的稻叶状氮掺杂碳纳米带，并将所述NRPCNRs作为荧光探针构建高灵敏、高选择性检测生物硫醇的荧光纳米传感器。2、由于Ag+离子与NRPCNRs上的N原子相互作用可以诱导NRPCNR发生荧光猝灭，形成非荧光配位络合物，而一旦在NRPCNRs-Ag+反应体系中加入生物硫醇，由于Ag+离子更容易与生物硫醇分子内的S原子形成稳定的Ag-S键，从而使结合在NRPCNRs上的Ag+释放出来，NRPCNRs的荧光强度就会恢复，并且NRPCNRs荧光强度的恢复程度与添加到反应体系中生物硫醇的量呈一定的相关性。3、本专利技术的基于NRPCNRs的无标记生物硫醇检测新方法能够有效地实现人血清中生物硫醇高灵敏、高选择性检测，并且方法简单、快速、线性检测范围宽，为高效检测生物样品中的生物硫醇提供了有效途径，具有潜在的应用价值。图说明图1为本专利技术实施例的溶液荧光光谱及荧光亮度示意图；其中，a.NRPCNRs(20μg/mL),b.NRPCNRs(20μg/mL)+Ag+(80μM),c.NRPCNRs(20μg/mL)+Ag+(80μM)+Cys(100μM),d.NRPCNRs(20μg/mL)+Cys(100μM)；内插图从左到右为不同溶液的荧光照片:1.NRPCNRs，2.NRPCNRs+Ag+，3.NRPCNRs+Ag++Cys，4.NRPCNRs+Cys。图2为本专利技术实施例检测方法中NRPCNRs的紫外光谱图以及NRPCNRs在355nm激发下的发射光谱图；内插图是NRPCNRs在1.自然光和2.紫外灯365nm照射下的图片。图3为本专利技术实施例检测方法中溶液的透射电镜(TEM)图；其中A.NRPCNRs，B.NRPCNRs-Ag+以及C.NRPCNRs-Ag+-Cys。图4为本专利技术实施例检测方法在最大发射波长420nm处得到NRPCNRs的荧光强度谱图；其中，检测条件变量为A.Ag+浓度，B.PBS缓冲液PH值。图5为本专利技术实施例检测方法采用NRPCNRs检测Cys和GSH的谱图：A.NRPCNRs-Ag+溶液，在Cys浓度从0至200μM下的荧光光谱；B.NRPCNRs荧光探针的相对荧光强度[(FL-FL0)/FL0]，随Cys浓度变化定量检测Cys浓度的标准曲线图；C.NRPCNRs-Ag+溶液，在GSH浓度从0至200μM下的荧光光谱；D.NRPCNRs荧光探针的[(FL-FL0)/FL0]，随GSH浓度变化定量检测GSH浓度的标准曲线图。图6为本专利技术实施例检测方法是NRPCNRs-Ag+检测不同生物样品的[(FL-FL0)/FL0]强度对比图，考察本专利技术检测方法中NRPCNRs对Cys的选择性。具体实施方式下面结合具体实施例及图对本专利技术做进一步解释说明，但应理解，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法，其特征在于，检测步骤包括：①将容器内依次加入磷酸缓冲盐溶液、稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针溶液和银离子溶液；②分组并加入含不同浓度生物硫醇的标准溶液和含未知浓度生物硫醇的待测样品，③稀释混匀后温育；④测定各组溶液荧光强度的变化；⑤以标准溶液组加入的生物硫醇浓度为横轴，标准溶液荧光恢复程度为纵轴，绘制标准曲线；⑥通过待测样品的荧光恢复程度与所述标准曲线对比，判定样品的生物硫醇浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法，其特征在于，检测步骤包括：①将容器内依次加入磷酸缓冲盐溶液、稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针溶液和银离子溶液；②分组并加入含不同浓度生物硫醇的标准溶液和含未知浓度生物硫醇的待测样品，③稀释混匀后温育；④测定各组溶液荧光强度的变化；⑤以标准溶液组加入的生物硫醇浓度为横轴，标准溶液荧光恢复程度为纵轴，绘制标准曲线；⑥通过待测样品的荧光恢复程度与所述标准曲线对比，判定样品的生物硫醇浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤①中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针与银离子的质量比为(2-3):1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤③中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针浓度为10-25μg/ml，银离子浓度为70-90μM。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤④中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带的氮掺杂含量为(35-37)wt％。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，荧光激发波长为355nm、激发和发射狭缝宽均为3nm。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，生物硫醇包括半胱氨酸和谷胱甘肽中的至少一种，优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥英，伊正君，乔晋娟，楚海荣，王颖，陈祥雨，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37