一种重组牛β‑乳球蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种重组牛β‑乳球蛋白(BLG)，氨基酸残基序列如SQE ID NO:1所示，优化核苷酸序列如SQE ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了一种重组牛β‑乳球蛋白(BLG)的制备方法，包括：将牛β‑乳球蛋白(BLG)优化基因整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达；通过培养已转化的宿主细胞，得到含有大量重组蛋白的发酵液；再对发酵液进行纯化，获得高纯度的重组牛β‑乳球蛋白(BLG)，简化了牛β‑乳球蛋白(BLG)的纯化工艺，降低了生产成本。本发明专利技术的重组牛β‑乳球蛋白可用于制备药物载体或功能食品保护剂，使用更安全。

A recombinant bovine beta lactoglobulin and preparation method and application thereof

The present invention relates to the field of gene engineering, in particular to a recombinant bovine beta lactoglobulin (BLG), amino acid sequence of SQE ID NO:1 shows, optimize the nucleotide sequence is shown as SQE ID NO:2. The invention also discloses a recombinant bovine beta lactoglobulin (BLG) preparation methods, including: bovine beta lactoglobulin (BLG) to optimize the gene into the expression vector, and the vector into the host cell expression; through training has been transformed into the host cell, fermentation liquid containing a large number of recombinant protein; then the fermented liquor was purified to obtain recombinant bovine beta lactoglobulin high purity (BLG), simplified bovine beta lactoglobulin (BLG) purification process, reduce the production cost. Recombinant bovine beta lactoglobulin of the invention can be used for preparing a drug carrier or functional food protection agents, use more safety.

【技术实现步骤摘要】
一种重组牛β-乳球蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)及其制备方法和应用。
技术介绍
β-乳球蛋白是牛奶中主要的乳清蛋白组分，可溶性强，支链氨基酸含量丰富，是乳清蛋白中半胱氨酸和甲硫氨酸的主要来源，具有很强的凝胶和乳化功能，能与视黄醇等脂溶性维生素或脂肪酸结合。β-乳球蛋白可作为辅助性配料用于乳制品、焙烤食品以及运动饮料等食品工业，它为食品工业开发新产品提供了机会，具有很高的市场价值和潜力(2013，葛继文等)。同时，食物中的维生素、脂肪酸、多酚等疏水小分子对机体代谢、疾病预防、抗氧化等有重要作用，但这类分子易受到光照、温度影响，很容易被氧化，且在人体胃肠道环境中容易丧失生物活性。β-乳球蛋白可以自动结合这类疏水分子，并对疏水配体的稳定性具有保护作用(2016，王枭鹏等)。牛β-乳球蛋白(BLG)主要从牛乳中分离得到，但牛乳成分复杂，单乳清中的蛋白种类就有几十种。直接从牛乳中大规模分离β-乳球蛋白，面临着工艺复杂，成本高等问题。近年来，由于对食品安全的重视，人们对于动物来源制品的要求也越来越高。传统从牛乳中分离制备牛β-乳球蛋白(BLG)的方法，虽然通过后续各种检测方法能检测出已知病毒、细菌等污染物，但对于未知的病毒、细菌，显得无能为力。而且一旦检测出病毒或细菌等污染，通过这种耗时耗力的方法获得的动物来源产品就要被销毁掉，这无疑是一种巨大的浪费。足见，现有技术还有待改善。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)及其制备方法和应用，增加了牛β-乳球蛋白(BLG)的安全性，简化了牛β-乳球蛋白(BLG)的纯化工艺，降低了生产成本。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)，所述牛β-乳球蛋白(BLG)的氨基酸残基序列如SQEIDNO:1所示。一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)，编码所述牛β-乳球蛋白(BLG)的优化核苷酸序列如SQEIDNO:2所示；优化前的核苷酸序列如SQEIDNO:3所示。进一步的，所述重组牛β-乳球蛋白(BLG)的氨基序列与自然型牛β-乳球蛋白(BLG)氨基酸序列相似度达到85％以上，最优选根据权利要求1所述的重组牛β-乳球蛋白(BLG)，其特征在于，所述重组牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列与自然型牛β-乳球蛋白(BLG)氨基酸序列仅3个氨基酸不同，相似度达98％。一种重组牛β-乳球蛋白(BLG)的制备方法，包括以下步骤：(1)优化牛β-乳球蛋白(BLG)核苷酸序列；(2)将(1)中优化的牛β-乳球蛋白(BLG)核苷酸序列(SQEIDNO:2)整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达；(3)通过培养(2)中已转化的宿主细胞，得到含有大量重组蛋白的发酵液；(4)再对(3)中发酵液进行纯化，获得高纯度的重组牛β-乳球蛋白(BLG)。进一步的，所述宿主细胞为食品级克鲁维酵母细胞、酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母或毕赤酵母中的一种；优选克鲁维酵母细胞。进一步的，所述重组牛β-乳球蛋白(BLG)或所述方法制得的牛β-乳球蛋白(BLG)应用于制备药物载体或功能食品保护剂。进一步的，所述重组牛β-乳球蛋白(BLG)或所述方法制得的牛β-乳球蛋白(BLG)应用于制备维生素B11保护剂。本专利技术有益效果：通过分子生物学方法克隆牛β-乳球蛋白(BLG)基因，然后将该基因整合到表达载体中，并用该载体转化各种宿主细胞进行表达；通过培养已转化的宿主细胞，得到的发酵液中含有大量的重组蛋白；然后，对发酵液进行纯化，获得高纯度的重组牛β-乳球蛋白(BLG)。本专利技术简化了牛β-乳球蛋白(BLG)的纯化工艺，降低了生产成本，更主要的是将本专利技术优化的牛β-乳球蛋白(BLG)核苷酸序列运用本专利技术的方法制备牛β-乳球蛋白(BLG)，易于工业化生产，全程操作易控，特别是对于病毒、细菌或其他因素所带来的污染，能得到有效控制甚至完全避免。克鲁维酵母是一般认为安全(GRAS，GenerallyRecognizedasSafe，FDA认证)的菌株之一，利用基因工程的方法大规模分泌表达β-乳球蛋白，目的蛋白可以占到上清总蛋白的80％以上，利用这种方法获取具β-乳球蛋白有明显的优势。所获得的重组蛋白在食品和药物领域具有多种用途，具有免受动物病毒污染，纯度高，成本低等优点。本专利技术获得的重组牛β-乳球蛋白(BLG)可以和维生素B11制备成络合物，对胃酸表现出了较好的耐受性，可以作为活性添加剂应用于食品工程、组织工程、药学以及美容护肤领域。附图说明图1为重组pKLAC1-BLG物理图谱。图2为含有牛β-乳球蛋白(BLG)基因片段的核苷酸电泳；泳道1是分子量标准；泳道2为BLG扩增产物。图3为含有牛β-乳球蛋白(BLG)基因的重组克鲁维酵母发酵上清SDS-PAGE实验结果：1为Marker；2为牛β-乳球蛋白(BLG)发酵上清；3为阳性对照；4为空白对照。图4为重组牛β-乳球蛋白(BLG)Western-blot实验结果；S1为发酵上清，S2为β-乳球蛋白标准品。图5为β-乳球蛋白-维生素B11络合物在胃酸中的稳定性变化图(VB11为维生素B11对照)，其中VB11为对照组，络合物为β-乳球蛋白与VB11络合物。具体实施方式为了更好的说明本专利技术技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式及相关实验进一步阐述。值得说明的是，本专利技术技术方案包含但不限于以下实施方式。实施例1重组牛β-乳球蛋白的表达1、牛β-乳球蛋白(BLG)基因的克隆根据NCBI公布的牛β-乳球蛋白的基因序列(SEQIDNo.3，NCBI登录号：X14712)，利用OptimumGene按照宿主密码子偏好性对其对应的碱基序列进行优化，优化位点多达131处，优化之后更有利于β-乳球蛋白在异源宿主克鲁维酵母或酿酒酵母、马克思克鲁维酵母、汉逊氏酵母、毕赤酵母等其他宿主细胞中的高效表达，并正确折叠包装。委托金斯瑞生物科技有限公司人工合成β-乳球蛋白成熟肽基因序列。对合成的基因用引入XhoI和NotI两端酶切位点，引入位点所用的引物为P-F:5'CCGCTCGAGAAAAGAAAGTGCCTCCTG3’(XHOI)(SEQIDNO:4)P-R:5’CCTTTTGCGGCCGCCTAGATGTGGCACTGCTCC3’(NotI)(SEQIDNo:5)PCR反应体系：引物P-F1.5μL(10mM),引物P-R1.5μL(10mM)，模版质粒1μL(50ng/μL)，EX-Taq酶(TaKaRa，货号RR001Q)0.5μL，补ddH2O至总体积50μL。PCR反应条件如下：94℃，2min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，循环30次；72℃延伸8min。扩增产物电泳(图2)显示500bp处有一条明亮的条带。然后委托英潍捷基公司对该PCR产物进行测序验证。2、构建重组表达载体pKLAC1-BLG对获得的基因片段采用XhoI和NotI酶切，然后引入pKLAC1质粒(购于NEB公司)中，得到的重组质粒命名为pKLAC1-BLG(图1)，经酶切及测序检测(英潍捷基生物公司)，序列正确(如SEQIDNo：4所示)。酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组牛β‑乳球蛋白，其特征在于，所述牛β‑乳球蛋白的氨基酸残基序列如SQE ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组牛β-乳球蛋白，其特征在于，所述牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列如SQEIDNO.1所示。2.一种重组牛β-乳球蛋白，其特征在于，编码所述牛β-乳球蛋白的优化的核苷酸序列如SQEIDNO:2所示。3.根据权利要求1所述的重组牛β-乳球蛋白，其特征在于，所述重组牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列与自然型牛β-乳球蛋白氨基酸序列的相似度至少为85％。4.根据权利要求3所述的重组牛β-乳球蛋白，其特征在于，所述重组牛β-乳球蛋白的氨基酸残基序列与自然型牛β-乳球蛋白氨基酸序列的相似度为98％。5.一种重组牛β-乳球蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)优化牛β-乳球蛋白核苷酸序列；(2)将(1)中优化的牛β-乳球蛋白核苷酸序列整合到表达载体中，并用该载体转化宿主细胞进行表达；(3)通...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘陈立，李小明，张齐，崔金明，蒙海林，黄建东，
申请(专利权)人：广州中国科学院先进技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44