一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫层析方法技术

本发明专利技术涉及免疫检测分析的技术领域，尤其是一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫层析方法，包含有血液、抗超敏C反应蛋白抗体、抗脂蛋白磷脂酶A2抗体、荧光试剂和检测器。抗超敏C反应蛋白抗体为抗超敏C反应蛋白单克隆抗体和抗超敏C反应蛋白多克隆抗体的一种或组合；抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为抗脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体和抗脂蛋白磷脂酶A2多克隆抗体的一种或组合；荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；检测器为荧光检测器。以人体血液为检测样本，可有效监测血液中超敏C反应蛋白及脂蛋白磷脂酶A2，特异性强，重复性好，灵敏度高，操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。

A fluorescent immunochromatographic method for quantitative detection of hypersensitive C reactive protein and lipoprotein phospholipase A2

The invention relates to the technical field of immunoassay analysis, especially fluorescence immunochromatographic method for quantitative detection of high sensitive C reactive protein and lipoprotein associated phospholipase A2, contains blood, anti hypersensitivity C protein antibody, anti A2 antibody and protein phospholipase fluorescence reagent and detector. Protein antibody anti hypersensitivity C is one or a combination of anti hypersensitivity C protein monoclonal antibody and anti hypersensitivity C protein polyclonal antibody; or a combination of anti lipoprotein antibody phospholipase A2 lipoprotein phospholipase A2 monoclonal antibody and anti lipoprotein phospholipase A2 polyclonal antibody; fluorescent reagent for liquid phase / containing the fluorescent substance or solid material, fluorescent material is one or a combination of organic fluorescent dyes or rare earth fluorescent dyes; fluorescence detector. In human blood samples for detection, which can effectively monitor the blood high-sensitivity C reactive protein and lipoprotein associated phospholipase A2, strong specificity, good reproducibility, high sensitivity, simple operation, no need of special equipment, without professional training, the clear, easy popularization, suitable for field detection.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫层析方法
本专利技术属于免疫检测分析
，尤其涉及一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫方法。
技术介绍
心脑血管疾病是严重威胁人类，特别是中老年人健康的常见病，全世界每年死于心脑血管病的人数高达千万人，居各种死因首位。经研究证实，心脑血管疾病发生发展很大程度上与动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)相关。定性定量的评估AS的严重性，有助于有效的预测和判断心脑血管栓塞状态，预防心脑血管事件的发生。AS是一种炎性疾病，炎症反应参与了其发生的各个环节，在AS的起始、发展以及稳定性丧失和斑块破裂脱落中均起着重要作用。Lp-PLA2是目前国际上公认的一种新的炎性反应标志物，血液中的Lp-PLA2主要由单核-巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞合成和分泌。血液中Lp-PLA2含量是预测心血管病、冠心病、脑卒中等疾病的风险预测因子。Lp-PLA2又称血小板活化因子乙酰水解酶，是一类催化脂蛋白和细胞膜上的甘油磷脂二位酰基酯键水解形成非酯化脂肪酸和溶血磷脂的酶族，属于扩大的磷脂酶A2超家族，但是与其他磷脂酶A2超家族成员不同，其生物活性不依赖于钙离子。Lp-PLA2编码基因(PLA2G7)于1995年首次被克隆，具有12个外显子，定位于6号染色体p21.2～12，由441个氨基酸残基组成的一种丝氨酸酯酶，分子量为45KDa。Lp-PLA2分两类，即在循环中分泌型的Lp-PLA2和存在于动脉粥样斑块中的Lp-PLA2。循环分泌型的Lp-PLA2约70%～80%与低密度脂蛋白LDL结合，20%～30%与高密度脂蛋白或其他脂蛋白结合。Lp-PLA2与LDL结合，生成溶血卵磷脂(Lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游离脂肪酸(OxidizedFreeFattyAcids，Ox-FA)，两者为促炎性物质，通过刺激产生黏附因子和细胞因子，而促进单核细胞由血管腔向血管内膜聚集。然后，单核细胞在内膜下聚集后衍生为巨噬细胞。最后巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白变成泡沫细胞，最终聚集成AS斑块。AS因为其普及面广，在人体内潜伏期长，最后往往以局部缺血、心绞痛、心肌梗塞、中风、冠心病或心力衰竭等致命病的形式爆发。从根本上说心脑血管事件的发生很大程度上取决于AS斑块的稳定性。Lp-PLA2活性反应动脉粥样硬化病变程度，与易损斑块的稳定性有关，相对于稳定性斑块，不稳定斑块的Lp-PLA2的活性明显升高。Lp-PLA2与其他炎性因子如C-反应蛋白等相比，因受其他危险因素的影响较小，继而检测具有更高的灵敏度和特异性。CRP是一种Υ球蛋白，分子量为105KD，，是在感染和组织损伤时血浆浓度快速，急剧升高的主要的急性期蛋白。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。1930年，研究人员发现，某些急性感染患者的血清能与肺炎链球菌荚膜C多糖发生沉淀反应，并证实造成沉淀反应的是一种蛋白质，且急、慢性炎症均存在此种反应。这种非特异性炎症蛋白被称为C-反应蛋白（CRP）。CRP由5个含206个氨基酸的相同单体以非共价键构成，蛋白的排列类似淀粉样蛋白P.CRP结构中含结晶样的钙结合环，一个亚单位与另一个亚单位的钙部位相连成五聚体结构。CRP由炎性淋巴因子刺激肝脏和上皮细胞合成，目前尚未发现CRP先天性缺乏。CRP通过终末协调复合物（C5b-9）参与早期AS的形成。在斑块表面的脆弱部位，单核细胞（巨噬细胞）、T淋巴细胞大量渗入，使斑块不稳定而破裂。在此过程白细胞介素（IL）-6引起肝脏合成CRP增加。动脉粥样硬化(atherosclerosis)斑块内CRPmRNA较正常动脉和肝脏中高7～10倍。AS斑块内激活的补体和CRP,使斑块不稳定和破裂，最终导致血栓形成。因此，升高的CRP有引起血栓形成的危险。临床上超敏C反应蛋白（hs-CRP）在严重冠心病猝死患者中显着升高，hs-CRP与免疫组化染色的AS薄帽的强度和数量有关。总之，hs-CRP与AS的程度密切相关，成为反映AS炎性活动的指标。将两者结合，进行联合检测可以更加准确有效地评估AS的严重性，诊断心肌损伤及其程度。Lp-PLA2在临床上的检测方法，主要有免疫比浊法、化学发光法、酶联免疫法及胶体金法。hs-CRP的检测方法有单向免疫扩散法、胶乳凝集法、酶联吸附法、速率散射比浊法等。胶体金法是最为常用的快速检测手段之一。因此，采用胶体金法，开发一快速、简便、准确并且费用低廉的心脑血管疾病的诊断试剂盒具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术中存在的不足，提供一种灵敏度高、准确性强、操作简便、能够快速诊断超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫层析检测方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用荧光免疫层析技术，具体的技术方案为：为解决上述技术问题，本专利技术采用荧光免疫层析技术，具体的技术方案为：一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫层析方法，包含有血液、抗超敏C反应蛋白抗体、抗脂蛋白磷脂酶A2抗体、荧光试剂和检测器。所述超敏C反应蛋白抗体为抗超敏C反应蛋白单克隆抗体和抗超敏C反应蛋白多克隆抗体的一种或组合；所述抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为抗脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体和抗脂蛋白磷脂酶A2多克隆抗体的一种或组合；所述荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，所述荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；所述检测器为荧光检测器。进一步的，所述的检测方法包括如下步骤：步骤(1)：用化学交联或生物分子间特异性作用分别将荧光染料偶联到单克隆抗体，得到荧光染料修饰的单克隆抗体，波长范围为300～1300nm；步骤(2)：将步骤(1)得到的荧光染料修饰的单克隆抗体固定到标记垫上；步骤(3)：在层析膜上分别设置一条定量检测线和一条质控线，其中，质控线上固定有能与单克隆抗体特异性结合的羊抗小鼠IgG，试剂条定量检测线上固定有多克隆抗体，且该特异性抗体所识别的抗原决定簇与固定在标记垫上的荧光染料修饰的单克隆抗体所识别的抗原决定簇不同；步骤(4)：将样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条；步骤(5)：将荧光免疫层析试纸条装卡。本专利技术采用化学交联或生物分子间特异性作用将荧光染料偶联到单克隆抗体的表面，得到荧光染料修饰的单克隆抗体。在本专利技术中，当荧光染料表面存在活性基团时，可将其直接与特异性抗体反应，不需用化学交联剂；反之，则需通过化学交联剂偶联。其中，化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及戊二醛等。在本专利技术的一个优选实施例中，采用有活性基团的荧光染料修饰单克隆抗体，步骤为：将纯化后的荧光染料溶解，然后加入一定量的单克隆抗体，以缓冲液作为反应介质，反应2～4小时，加入盐酸羟胺终止反应，用色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，得到荧光染料修饰的单克隆抗体。为了提高信号与背景的区分度，本专利技术中荧光染料的波长范围为300～1300nm，优选为550-800nm。此外，层析膜、底板和扣卡一般在近红外本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫层析方法，包含有血液、抗超敏C反应蛋白抗体、抗脂蛋白磷脂酶A2抗体、荧光试剂和检测器，具有如下特征：1）所述超敏C反应蛋白抗体为抗超敏C反应蛋白单克隆抗体和抗超敏C反应蛋白多克隆抗体的一种或组合；2）所述抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为抗脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体和抗脂蛋白磷脂酶A2多克隆抗体的一种或组合；3）所述荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，所述荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；4）所述检测器为荧光检测器。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2的荧光免疫层析方法，包含有血液、抗超敏C反应蛋白抗体、抗脂蛋白磷脂酶A2抗体、荧光试剂和检测器，具有如下特征：1）所述超敏C反应蛋白抗体为抗超敏C反应蛋白单克隆抗体和抗超敏C反应蛋白多克隆抗体的一种或组合；2）所述抗脂蛋白磷脂酶A2抗体为抗脂蛋白磷脂酶A2单克隆抗体和抗脂蛋白磷脂酶A2多克隆抗体的一种或组合；3）所述荧光试剂为含有所述荧光物质的液相和/或固相材料，所述荧光物质为有机荧光染料或稀土元素荧光染料的一种或组合；4）所述检测器为荧光检测器。2.根据权利要求1所述的一种定量检测超敏C反应蛋白和脂蛋白磷脂酶A2荧光免疫检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：1）用化学交联或生物分子间特异性作用将荧光染料偶联到特异性抗体1表面，得到荧光染料修饰的特异性抗体载体，荧光染料的发射波长范围为300～1300nm；2）制备荧光免疫层析试纸条，所述荧光免疫层析试纸条包括标记垫、层析膜、吸水垫和底板；3）配置清洗缓冲液，所述清洗缓冲液包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性剂，pH值为7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.05～2％，蔗糖的浓度为1～15％，表面活性剂的浓度为0.05～2％；4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亚星，刘凤鸣，刘冰，
申请(专利权)人：常州博闻迪医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32