基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法。将多种蛋白(mBcrp、hBCRP、mMrp2、hMRP2、OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1)过表达细胞系作为研究OTA转运的细胞模型，设计transwell和uptake实验，在不同pH下检测不同蛋白在OTA转运、吸收中所起的作用。对OTA的肝肾毒性研究有重要意义，对治疗OTA引发的肾脏疾病提供理论基础，在完善、保障人体健康方面具有重要意义。

Detection of OTA transport in vitro based on Transwell and uptake Technology

The present invention discloses a method for detecting OTA transport in vitro based on Transwell and uptake technology. A variety of protein (mBcrp, hBCRP, mMrp2, hMRP2, OATP1B1, OATP1A2 or OATP2B1) over expressed cell lines were used as cell models to study OTA transport. Transwell and uptake experiments were designed to detect the role of different proteins in the transport and absorption of OATP1B1 under different pH. It is important for OTA to study the toxicity of liver and kidney, and to provide theoretical basis for treating OTA induced kidney disease. It is of great significance to improve and protect human health.

【技术实现步骤摘要】
基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法。
技术介绍
赭曲霉毒素A(OTA)是一种由青霉属(Penicillium.sp)和曲霉属(Aspergillus.sp)真菌产生的次级代谢产物。OTA污染范围广，包括小麦、大豆、玉米、燕麦、大麦、咖啡豆、肉、乳酪等。1989年，美国国家毒理学计划发表声明，认为OTA是真菌毒素中最强的肾致癌物质，可以导致全部哺乳动物肾毒性。OTA与人的肾病相关，是巴尔干肾病的可能诱因，动物实验报道OTA的暴露与尿道癌、肝癌、乳腺癌有因果联系。另外，OTA还具有肝毒性、生殖毒性、神经毒性、免疫毒性等多种毒性。经典的OTA肾脏转运系统中，OTA分泌主要是通过近端小管的有机阴离子转运系统，分泌的OTA被近端小管、末端小管、收集管重吸收，导致OTA在近端小管细胞的积累。ABC(ATP-bindingcassette)转运体是广泛分布在多个组织的跨膜蛋白。在OTA的研究中，ABC家族的两个成员是潜在的OTA转运蛋白，多药耐受相关蛋白2(MRP2)和乳腺癌耐受蛋白(BCRP)。它们位于肝细胞、肾近端小管、肠细胞顶膜，是外排蛋白。有研究表明OTA抑制MRP2介导的PAH转运，OTA本身也是MRP2的底物。前人用Caco-2细胞研究报道OTA可能是BCRP的底物。但是对于它们能否转运OTA存在争议。目前的研究认为有机阴离子转运多肽(OATPs)，尤其是OATP1A/1B家族对药物、分子在机体内的分布、排泄起作用。它们主要在肝、肾、小肠中表达，人OATP1B1和OATP1B3主要在肝细胞基底膜表达。人OATP1A2主要在顶膜表达，包括肠上皮细胞，远端肾单位细胞等。人OATP2B1广泛分布在肝细胞基底膜，肠细胞顶膜等。之前的报道称Oatp1a1、Oatp1a3v1、Oatp1a3v2和Oatp1a4能介导OTA的转运，但都是大鼠或小鼠的蛋白。对于OTA如何进入肾脏、肝脏，进而损伤靶器官，或者OTA是如何从脏器中排出，进而排出体外，至今尚无确切结论。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种用于研究OTA转运的细胞模型，包括过表达基因mBcrp、hBCRP、mMrp2、hMRP2、OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1的细胞系；所述细胞系是通过基因工程手段将上述基因分别构建到表达载体上，得到重组表达载体，然后将各基因对应的重组表达载体转入肾脏、肝脏或肠组织来源的细胞系中，构建得到过表达上述各基因的细胞系。本专利技术所述肾脏来源的细胞系包括但不限于MDCK-Ⅱ或HEK293。本专利技术中使用的细胞模型均由荷兰癌症研究所AlfredSchinkel实验室提供。参见LagasJS,CmVDK,VandWK,etal.Transportofdiclofenacbybreastcancerresistanceprotein(ABCG2)andstimulationofmultidrugresistanceprotein2(ABCC2)-mediateddrugtransportbydiclofenacandbenzbromarone.[J].DrugMetabolism&DispositiontheBiologicalFateofChemicals,2009,37(1):129-136.ZimmermannC,VandWK,VandSE,etal.Species-dependenttransportandmodulationpropertiesofhumanandmousemultidrugresistanceprotein2(MRP2/Mrp2,ABCC2/Abcc2).[J].DrugMetabolism&DispositiontheBiologicalFateofChemicals,2008,36(4):631-640.本专利技术还提供一种基于transwell技术体外检测OTA转运的方法，利用上述细胞模型，向细胞培养液中添加OTA，孵育一段时间后，通过检测细胞培养液中OTA的含量变化，从而分析蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2对OTA的转运能力。前述的方法，还包括向细胞培养液中添加蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2的抑制剂的步骤，从而分析各种抑制剂对不同蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2介导的OTA转运的影响。优选地，所述抑制剂为Ko143。前述的方法，还包括调节细胞培养液pH值的步骤，从而分析各种pH值条件下，对不同蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2介导的OTA转运的影响。优选地，所述pH值为7.4(人体正常血液环境)或6.4(微酸性环境)。本专利技术还提供一种基于uptake技术体外检测OTA转运的方法，利用上述细胞模型，向细胞培养液中添加OTA，孵育一段时间后，裂解细胞，通过检测细胞裂解液中OTA的含量，从而分析蛋白OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1对OTA的转运能力。前述的方法，还包括向细胞培养液中添加蛋白OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1的抑制剂的步骤，从而分析各种抑制剂对不同蛋白OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1介导的OTA转运的影响。优选地，所述抑制剂为CsA(环孢菌素A)。前述的方法，还包括调节细胞培养液pH值的步骤，从而分析各种pH值条件下，对不同蛋白OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1介导的OTA转运的影响。优选地，所述pH值为7.4(人体正常血液环境)或6.4(微酸性环境)。在本专利技术的基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法中，可向细胞培养液中加入同位素标记的OTA，然后通过向细胞培养液或细胞裂解液中加入液相闪烁试剂，在液体闪烁计数仪上检测OTA含量。本专利技术还提供Ko143和/或CsA在制备用于治疗OTA引发的肾脏疾病的药物中的应用。本专利技术进一步提供一种用于减轻由OTA引起的哺乳动物肾毒性的药物，其有效成分为Ko143和/或CsA。本专利技术具有以下优点：(一)本专利技术在mBcrp、hBCRP、mMrp2、hMRP2、OATP1B1、OATP1A2、OATP2B1基因过表达的细胞模型中，在两种pH环境下，利用同位素标记OTA，直接观察/检测OTA的转运、吸收情况。对OTA的肝肾毒性研究有重要意义，对治疗OTA引发的肾脏疾病提供理论基础，在完善、保障人体健康方面具有重要意义。(二)分别在pH7.4、pH6.4的条件下，模拟人体正常血液环境和微酸性环境，分析不同蛋白对OTA转运、吸收的影响。(三)首次比较了鼠Bcrp、Mrp2和人BCRP、MRP2蛋白在转运OTA上的区别。(四)首次公开了人OATP1B1、OATP1A2、OATP2B1在吸收OTA中的作用。附图说明图1为本专利技术实施例1中OTA对MDCK细胞生长的影响。其中，A：MDCKII细胞受OTA处理或OTA与Ko143共处理；B：mBcrp过表达细胞受OT本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于研究OTA转运的细胞模型，其特征在于，包括过表达基因mBcrp、hBCRP、mMrp2、hMRP2、OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1的细胞系；所述细胞系是通过基因工程手段将上述基因分别构建到表达载体上，得到重组表达载体，然后将各基因对应的重组表达载体转入肾脏、肝脏或肠组织来源的细胞系中，构建得到过表达上述各基因的细胞系。

【技术特征摘要】
1.用于研究OTA转运的细胞模型，其特征在于，包括过表达基因mBcrp、hBCRP、mMrp2、hMRP2、OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1的细胞系；所述细胞系是通过基因工程手段将上述基因分别构建到表达载体上，得到重组表达载体，然后将各基因对应的重组表达载体转入肾脏、肝脏或肠组织来源的细胞系中，构建得到过表达上述各基因的细胞系。2.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于，其是将各基因对应的重组表达载体转入肾脏来源的细胞系中构建得到的，所述肾脏来源的细胞系为MDCK-Ⅱ或HEK293。3.基于transwell技术体外检测OTA转运的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的细胞模型，向细胞培养液中添加OTA，孵育一段时间后，通过检测细胞培养液中OTA的含量变化，从而分析蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2对OTA的转运能力。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括向细胞培养液中添加蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2的抑制剂的步骤，从而分析各种抑制剂对不同蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2介导的OTA转运的影响；优选地，所述抑制剂为Ko143。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，黄昆仑，许文涛，祁潇哲，朱丽叶，贺晓云，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11