一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其具有较高的基因编辑效率。该基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列插入位点；cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子，cas9序列如SEQ ID No.5所示，SD序列如SEQ ID No.6所示；sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子，sgRNA scaffold序列包括trancrRNA和crRNA插入位点，sgRNA scaffold序列如SEQ ID No.7所示；复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA。

Gene editing vector of Corynebacterium glutamic acid, preparation method, system and application thereof

The invention provides a gene editing vector of Corynebacterium glutamic acid, which has high gene editing efficiency. The carrier includes a gene editing element, sgRNA element, the expression of Cas9 replication and homologous sequence insertion site repair components; the expression of cas9 elements including resistance gene, operon, promoter, SD sequence, cas9 sequence and cas9 terminator sequences such as SEQ ID No.5 shows, SD sequence such as SEQ ID No.6 shown; sgRNA expression element contains sgRNA promoter, scaffold terminator and sequence, sgRNA scaffold sequence including trancrRNA and crRNA insertion site, sgRNA scaffold sequence as shown in SEQ ID No.7; replicon elements contain Corynebacterium glutamicum repA replicon.

【技术实现步骤摘要】
一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、系统及其应用
本专利技术涉及基因编辑领域，具体涉及一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体、制备方法、系统及其应用。
技术介绍
对于工业微生物来说，从野生型出发菌株到高效的生产菌株需要经历代谢分析及优化，利用基因编辑技术对宿主进行遗传修饰及合理改造。基因编辑技术是指利用外源DNA通过重组方式对受体细胞基因组目标基因进行突变，从而产生目的突变株。基因编辑需要实现基因敲除，基因插入及基因替换等基因组操作。CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)/Cas9系统是细菌和古细菌应对外源DNA入侵的获得性免疫系统，通过RNA介导，Cas9蛋白能够特异性的切割外源遗传物质，用以对抗入侵的病毒和质粒。随着近两年的发展，该技术已经发展成为一套精确的基因编辑系统，通过CRISPR/Cas9介导的打靶系统可以试验快速高效的基因敲除、基因敲入、基因沉默。目前该技术已成功应用到动物细胞、大肠杆菌、拟南芥、酿酒酵母等物种中。CRISPR/Cas9系统发挥基因编辑的作用是建立在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列插入位点；所述cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子，所述cas9序列如SEQ ID No.5所示，所述SD序列如SEQ ID No.6所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前；所述sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNA scaffold序列和终止子，所述sgRNA scaffold序列包括trancrRNA和crRNA插入位点，所述crRNA插入位点为AjuI酶切位点，所述sgRNA scaffold序列如SEQ ID ...

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体包括Cas9表达元件、sgRNA表达元件、复制子元件和同源修复序列插入位点；所述cas9表达元件包括抗性基因、操纵子、启动子、SD序列、cas9序列和终止子，所述cas9序列如SEQIDNo.5所示，所述SD序列如SEQIDNo.6所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前；所述sgRNA表达元件的包含启动子、sgRNAscaffold序列和终止子，所述sgRNAscaffold序列包括trancrRNA和crRNA插入位点，所述crRNA插入位点为AjuI酶切位点，所述sgRNAscaffold序列如SEQIDNo.7所示；所述复制子元件包含谷氨酸棒状杆菌复制子repA；所述同源修复序列插入位点连接于所述sgRNA表达元件的终止子后。2.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：所述cas9表达元件的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其抗性基因为cat氯霉素抗性基因，操纵子为lacIq，启动子为Ptac，终止子为rrnB；所述sgRNA表达元件的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，其启动子为Ptrc，终止子为T1T2；所述复制子元件的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述复制子原件还包括大肠杆菌复制子oriE；所述同源修复序列插入位点包括AflII酶切位点、BstBI酶切位点、SnaBI酶切位点和SwaI酶切位点。3.根据权利要求2所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体，其特征在于：所述基因编辑载体的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。4.如权利要求3所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑载体的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤，a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列，并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列；将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀霞，彭枫，王新月，孙杨，杨艳坤，白仲虎，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32