一种可联合丙戊酸共同使用提高表达水平的抗凋亡CHO‑K1细胞系的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种可联合丙戊酸共同使用提高表达水平的抗凋亡CHO‑K1细胞系的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：(1)在BAK、BAX基因的外显子上分别设计出相应的sgRNA序列；(2)制备PSK‑sgRNA‑BAK、PSK‑sgRNA‑BAX质粒；(3)将质粒转染至CHO‑K1细胞中，之后经过筛选，挑选单克隆；获得不同的细胞系；(4)Western Blot检测；(5)功能鉴定及验证；(6)利用敲除型细胞系构建的外源蛋白表达细胞系能联同丙戊酸一起使用，进一步的提升外源蛋白表达水平。本发明专利技术制得的稳定细胞系能够延长其重组蛋白合成时间，获得更多的重组蛋白。

A combination of valproic acid in common use to improve the construction method of CHO anti apoptosis level cell expressed K1

The invention discloses a combination of valproic acid in common use to improve the construction method of CHO anti apoptosis level expression in K1 cells, the construction method comprises the following steps: (1) in BAK and BAX exons were designed corresponding sgRNA sequence; (2) preparation of PSK sgRNA BAK, PSK sgRNA plasmid BAX; (3) the plasmid was transfected into CHO K1 cells, after screening, selection of monoclonal; different cell lines; (4) Western (5) Blot detection; function identification and verification; (6) using knockout can together with valproic acid. The use of cell lines expressing cell lines to construct the source protein, further improve the expression level of foreign protein. The stable cell line produced by the invention can prolong the synthesis time of the recombinant protein and obtain more recombinant proteins.

【技术实现步骤摘要】
一种可联合丙戊酸共同使用提高表达水平的抗凋亡CHO-K1细胞系的构建方法
本专利技术涉及生物制药
，尤其是涉及一种利用CRISPR/Cas9技术同时敲除BAK和BAX基因，构建具有抗凋亡特性的CHO-K1细胞系的方法。
技术介绍
中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvarycell,CHO)是当前被普遍利用于生产各种治疗性蛋白的哺乳动物细胞，它具有多项优势，如：CHO细胞可以在化学成分确定且无血清的培养基中旺盛生长，其基因组内不含人源性致病病毒而相对安全，能够对重组蛋白进行类似于人类蛋白的翻译后修饰。通过对野生型CHO细胞进行细胞工程改造，可以获得不同细胞系以提升后期稳定细胞株表达重组蛋白的水平。一般通过增加或敲除CHO细胞基因组中某些基因，来改变CHO细胞的特性，传统上敲除一个基因就需要构建出含有相关的sgRNA序列的质粒，并将其同Cas9质粒共同转染到细胞内，对基因进行敲除，对细胞进行单克隆删选，在筛选到单克隆后进行DNA，蛋白及功能等一系列鉴定后，需要对第二个基因进行上述同样的操作，故传统方法对于基因敲除费时费力。现有技术主要是通过构建细胞系后多轮的单克隆筛选来获得高表达细胞系，并利用一些添加剂在后期增大外源蛋白的表达水平。而本专利的特点在于对细胞本身进行改造，使得其具有更好的抗凋亡水平，此外在联通相关的添加剂使用时，也能更好的克服其带来的毒性，将其促进细胞高水平表达外源蛋白的能力更好的激发出来。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种可联合丙戊酸共同使用提高表达水平的抗凋亡CHO-K1细胞系的构建方法。本专利技术方法利用CRISPR/Cas9技术同时敲除BAK和BAX基因的方法，制得BAKBAX敲除型CHO-K1细胞系，该细胞系可以在后续利用G418筛选并构建出重组蛋白高表达细胞系，利用该敲除方法，可以同时将多个基因敲除，这大大节省了分次敲除所花费的时间，该敲除型细胞系构建而来的稳定细胞系能够延长其重组蛋白合成时间，获得更多的重组蛋白；并且该敲除型细胞系可以联合丙戊酸等添加剂共同使用，进一步提升重组蛋白表达水平。本专利技术的技术方案如下：一种可联合丙戊酸共同使用提高表达水平的抗凋亡CHO-K1细胞系的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：(1)在BAK、BAX基因的外显子上分别设计并合成出相应的sgRNA序列；(2)将步骤(1)制得的两对序列分别通过95℃水浴后再降温到室温，之后将其同BBsI酶切后的PSK-u6-gRNA载体用T4连接酶16℃下过夜连接，之后再通过转化感受态细胞获得单克隆，制得新的质粒分别为PSK-sgRNA-BAK、PSK-sgRNA-BAX；(3)将步骤(2)所得的PSK-sgRNA-BAK、PSK-sgRNA-BAX质粒，与CD513B-Cas9质粒，三质粒一起转染至CHO-K1细胞中，之后经过筛选，挑选单克隆；获得不同的细胞系；(4)对BAK与BAX基因的靶点上下游约300-500bp范围内进行PCR扩增，并测序以鉴定是否存在删除或插入现象；将鉴定好存在敲除或插入的细胞系裂解后提取总蛋白，并进行WesternBlot检测，以确保BAKBAX蛋白均不存在；制得敲除型细胞的CHO-K1细胞系，即所述抗凋亡CHO-K1细胞系；(5)将步骤(4)中鉴定为敲除型细胞的CHO-K1细胞系再进行功能鉴定以及验证敲除型CHO-K1细胞是否可以使用G418筛选；(6)利用敲除型细胞系构建的外源蛋白表达细胞系能联同丙戊酸一起使用，进一步的提升外源蛋白表达水平。所述BAK基因的一对sgRNA序列为：5’-TTTGGGAAGCCGGTCAAACCACGTGT-3’，5’-TAAAACACGTGGTTTGACCGGCTTCC-3’；所述BAX基因的一对sgRNA序列为：5’-TTTGGCTGATGGCAACTTCAACTGGT-3’，5’-TAAAACCAGTTGAAGTTGCCATCAGC-3’。所述步骤(3)的详细过程为：三种质粒按照比例转染至CHO-K1细胞48小时后，加入3-10ug/ml的puromycin对细胞进行筛选，经过72h筛选后，将培养液替换成常规的不含puromycin的培养液，再培养两天后，将细胞收集并计算下细胞密度，将细胞稀释到5个/ml后，接种到96孔板内，每个孔内100ul培养液，确保每孔细胞数量为0.5个，等细胞在96孔板内长满后将其逐步扩陪到24孔板与6孔板内，最终获得BAKBAX基因敲除细胞系，利用DNA提取试剂盒提取单克隆细胞的基因组DNA；所述PSK-sgRNA-BAK、PSK-sgRNA-BAX质粒的摩尔量分别大于Cas9质粒的摩尔量。步骤(4)中所述BAK基因扩增的条件为：扩增产物大小为332bp、延伸时间20S、退火温度为62-67℃；所述BAX基因扩增的条件为：扩增产物大小为327bp、延伸时间20S、退火温度为62-67℃。步骤(4)中所述扩增过程中引物为：BAKfwdT:5’GATGGGGAGGAGGCAAAC3’；BAKrevT:5’AGGGGTGGGTTACAGAGTG3’；BAXfwdT：5’CGGCCTTGGTTTCCTCATC3’；BAXrevT：5’CACAGTCATCTCTCTCCATTCCC3’。步骤(5)中所述鉴定方法为将将敲除型细胞DNA经PCR扩增后将产物进行电泳，并将条带回收后测序，同野生型序列进行比对，以观察是否在DNA层面上出现了删除或插入现象。在进行westernblot时，anti-BAK及anti-BAX抗体用于检测若干个DNA层面上发生删除或插入的细胞系是否也已经不再表达BAK及BAX蛋白，而anti-GAPDH的作用是确保实验过程中每个泳道的总蛋白含量相近，以此可以比对敲除型细胞系的BAK及BAX蛋白较之野生型细胞系是否有极为显著的降低或完全消失。Westernblot操作如下：将野生型细胞裂解液及各个敲除型细胞系裂解液通过BCA方法检测蛋白总浓度后，向各个总蛋白样品内加入蛋白电泳loadingbuffer并在100℃下煮样5min；再将样品等质量的添加到各个SDS-PAGE胶内泳道中(野生型细胞总蛋白质量也可以小于其余敲除型细胞系的总蛋白质量，但不得大于)，在150V条件下电泳1h，将胶取出后，在将胶上的蛋白在100V条件下转移到硝酸纤维素膜上，转膜时间为90min。取出膜用5％脱脂奶粉室温下震荡封闭2h。再用5％脱脂奶粉稀释anti-BAK抗体，室温下震荡孵育1h，再用5％脱脂奶粉稀释二抗后室温下震荡孵育1h。最后在膜上孵育ECL发光液并曝光获取图像。之后将膜从中间剪开后，用膜再生液去除膜表面的抗体，之后再用5％脱脂奶粉室温下震荡封闭2h。之后再对两个小膜分别用5％脱脂奶粉稀释过的anti-BAX及anti-GAPDH抗体在室温下震荡孵育1h。再用5％脱脂奶粉稀释二抗后室温下震荡孵育1h。最后在膜上孵育ECL发光液并曝光获取图像信息。步骤(6)中所述鉴定方法为：将敲除BAK和BAX基因的CHO-K1细胞及野生型细胞均进行puromycin的诱导凋亡，48h后，通过AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒，AnnexinV-FITC/PropidiumIodide本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可联合丙戊酸共同使用提高表达水平的抗凋亡CHO‑K1细胞系的构建方法，其特征在于所述构建方法包括如下步骤：(1)在BAK、BAX基因的外显子上分别设计出相应的sgRNA序列并合成；(2)将步骤(1)制得的两对序列分别通过95℃水浴后再降温到室温，之后将其同BBsI酶切后的PSK‑u6‑gRNA载体用T4连接酶16℃下过夜连接，之后再通过转化感受态细胞获得单克隆，制得新的质粒分别为PSK‑sgRNA‑BAK、PSK‑sgRNA‑BAX；(3)将步骤(2)所得的PSK‑sgRNA‑BAK、PSK‑sgRNA‑BAX质粒与Cas9质粒，三质粒一起转染至CHO‑K1细胞中，之后经过筛选，挑选单克隆；获得不同的细胞系；(4)对BAK与BAX基因的靶点上下游约300‑500bp范围内进行PCR扩增，并测序以鉴定是否存在删除或插入现象；将鉴定好存在敲除或插入的细胞系裂解后提取总蛋白，并进行Western Blot检测，以确保BAK BAX蛋白均不存在；制得敲除型CHO‑K1细胞系；(5)将步骤(4)中鉴定为敲除型细胞的CHO‑K1细胞系再进行抗凋亡功能鉴定，确定其为抗凋亡CHO‑K1细胞系并验证敲除型CHO‑K1细胞是否可以使用G418筛选；(6)利用敲除型细胞系构建的外源蛋白表达细胞系能联同丙戊酸一起使用，进一步的提升外源蛋白表达水平。...

【技术特征摘要】
1.一种可联合丙戊酸共同使用提高表达水平的抗凋亡CHO-K1细胞系的构建方法，其特征在于所述构建方法包括如下步骤：(1)在BAK、BAX基因的外显子上分别设计出相应的sgRNA序列并合成；(2)将步骤(1)制得的两对序列分别通过95℃水浴后再降温到室温，之后将其同BBsI酶切后的PSK-u6-gRNA载体用T4连接酶16℃下过夜连接，之后再通过转化感受态细胞获得单克隆，制得新的质粒分别为PSK-sgRNA-BAK、PSK-sgRNA-BAX；(3)将步骤(2)所得的PSK-sgRNA-BAK、PSK-sgRNA-BAX质粒与Cas9质粒，三质粒一起转染至CHO-K1细胞中，之后经过筛选，挑选单克隆；获得不同的细胞系；(4)对BAK与BAX基因的靶点上下游约300-500bp范围内进行PCR扩增，并测序以鉴定是否存在删除或插入现象；将鉴定好存在敲除或插入的细胞系裂解后提取总蛋白，并进行WesternBlot检测，以确保BAKBAX蛋白均不存在；制得敲除型CHO-K1细胞系；(5)将步骤(4)中鉴定为敲除型细胞的CHO-K1细胞系再进行抗凋亡功能鉴定，确定其为抗凋亡CHO-K1细胞系并验证敲除型CHO-K1细胞是否可以使用G418筛选；(6)利用敲除型细胞系构建的外源蛋白表达细胞系能联同丙戊酸一起使用，进一步的提升外源蛋白表达水平。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述BAK基因的一对sgRNA序列为：5’-TTTGGGAAGCCGGTCAAACCACGTGT-3’，5’-TAAAACACGTGGTTTGACCGGCTTCC-3’；所述BAX基因的一对sgRNA序列为：5’-TTTGGCTGATGGCAACTTCAACTGGT-3’，5’-TAAAACCAGTTGAAGTTGCCATCAGC-3’。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述步骤(3)的详细过程为：三种质粒按照比例转染至CHO-K1细胞48小时后，加入3-10μg/ml的puromycin...

【专利技术属性】
技术研发人员：周松涛，曹啸东，金坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32