本发明专利技术公开了一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：口腔黏膜组织的预处理；口腔黏膜细胞的分离；口腔黏膜上皮细胞体外培养；口腔黏膜上皮细胞消化传代。本发明专利技术公开了一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，对口腔粘膜组织预处理后分离得到口腔黏膜细胞，并对细胞进行体外培养，最后通过逆转录病毒感染体外培养细胞得到重编程细胞，该方法操作步骤简单，取材方便，为多能干细胞的临床推广提供了一种性质有效的操作步骤。
A method of reprogramming oral mucosal epithelial cells into pluripotent stem cells
The present invention discloses a kind of oral mucosal epithelial cells reprogrammed into pluripotent stem cells, the method comprises the following steps: pretreatment of oral mucosa; separation of oral mucosal cells; oral epithelial cells in vitro; oral mucosal epithelial cells of digestive passage. The present invention discloses a kind of oral mucosal epithelial cells reprogrammed into pluripotent stem cells, on oral mucosa after pretreatment of isolated oral mucosa cells, and the cells were cultured in vitro, finally by retroviral infection in vitro cell reprogramming cells, the method is simple, convenient, provides a kind of effective steps for clinical application of pluripotent stem cells.
【技术实现步骤摘要】
一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法
本专利技术属于生物医学领域，特别是涉及一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法。
技术介绍
上皮组织由密集排列的上皮细胞和极少量细胞间质构成的动物的基本组织。上皮细胞是位于皮肤或腔道表层的细胞。口腔上皮细胞是一种上皮细胞。人的口腔上皮细胞是扁平、多边形的，形状不很规则。人的口腔顶壁前部为硬腭，后部为软腭，两侧壁为颊部。口腔各壁都有黏膜覆盖。口腔上皮细胞主要分布在口腔两侧颊部。人口腔黏膜上皮细胞的体外培养对于研究口腔黏膜上皮细胞的生理、病理变化，上皮癌变过程以及组织工程化黏膜的构建具有重要意义。多年来，国内外许多学者一直致力于获得更为完善有效的口腔黏膜上皮细胞的培养体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，该方法操作步骤简单，取材方便，为多能干细胞的临床推广提供了一种性质有效的操作步骤。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：S1、口腔黏膜组织的预处理；S2、口腔黏膜细胞的分离；S3、口腔黏膜上皮细胞体外培养；S4、口腔黏膜上皮细胞消化传代。进一步地，S1中的具体步骤为，将口腔黏膜组织含有双抗的生理盐水清洗2-3次后，浸泡于2g/L庆大霉素溶液浸泡5-10min，之后用含有0.06％的苯扎溴铵浸泡8-15min，预处理结束后用眼科剪去除黏膜下组织，并将口腔黏膜组织修剪成1x1cm的组织块。进一步地，S2中的具体步骤为，将处理后的组织块置于0.4-0.6％的Dispase溶液中浸泡10-12h，4℃消化，取出后用眼科剪分离上皮层和下皮层，弃去下皮层。进一步地，S3中的具体步骤为，将上皮层细胞加入至0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，37℃消化20-30min，其中胰酶与EDTA的体积比为1：1，用10％胎牛血清中止消化，用吸管吹打单细胞悬液，1000r/min离心5-10min，弃上清，加入至DefinedK-SFM中重悬细胞，以2-3x104个/cm2接种至24孔培养板中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，3d后第一次换液，之后隔天换液一次。进一步地，S4中的具体步骤为，细胞培养10-12d后，吸去培养液，将细胞置于0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，用吸管反复吹打，之后800r/min离心10min，细胞沉淀用K-SFM重悬，细胞悬液以1：2比例传代培养，24-36h后第一次换液，之后隔天换液一次。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，对口腔粘膜组织预处理后分离得到口腔黏膜细胞，并对细胞进行体外培养，最后通过逆转录病毒感染体外培养细胞得到重编程细胞，该方法操作步骤简单，取材方便，为多能干细胞的临床推广提供了一种性质有效的操作步骤。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。具体实施方式本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术为一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，该方法具体步骤如下：实施例1一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，该方法包括如下步骤：S1、口腔黏膜组织的预处理；将口腔黏膜组织含有双抗的生理盐水清洗2次后，浸泡于2g/L庆大霉素溶液浸泡5min，之后用含有0.06％的苯扎溴铵浸泡8min，预处理结束后用眼科剪去除黏膜下组织，并将口腔黏膜组织修剪成1x1cm的组织块；S2、口腔黏膜细胞的分离；将S1中处理后的组织块置于0.4％的Dispase溶液中浸泡10h，4℃消化，取出后用眼科剪分离上皮层和下皮层，弃去下皮层；S3、口腔黏膜细胞的培养；将S2中得到的上皮层细胞加入至0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，37℃消化20min，其中胰酶与EDTA的体积比为1：1，用10％胎牛血清中止消化，用吸管吹打单细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，加入至DefinedK-SFM中重悬细胞，以2x104个/cm2接种至24孔培养板中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，3d后第一次换液，之后隔天换液一次；S4、细胞培养10d后，吸去培养液，将细胞置于0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，用吸管反复吹打，之后800r/min离心10min，细胞沉淀用K-SFM重悬，细胞悬液以1：2比例传代培养，24h后第一次换液，之后隔天换液一次；S5、通过逆转录病毒感染S4中制备的口腔黏膜上皮细胞，诱导口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞。实施例2S1、口腔黏膜组织的预处理；将口腔黏膜组织含有双抗的生理盐水清洗3次后，浸泡于2g/L庆大霉素溶液浸泡10min，之后用含有0.06％的苯扎溴铵浸泡15min，预处理结束后用眼科剪去除黏膜下组织，并将口腔黏膜组织修剪成1x1cm的组织块；S2、口腔黏膜细胞的分离；将S1中处理后的组织块置于0.6％的Dispase溶液中浸泡12h，4℃消化，取出后用眼科剪分离上皮层和下皮层，弃去下皮层；S3、口腔黏膜细胞的培养；将S2中得到的上皮层细胞加入至0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，37℃消化30min，其中胰酶与EDTA的体积比为1：1，用10％胎牛血清中止消化，用吸管吹打单细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，加入至DefinedK-SFM中重悬细胞，以3x104个/cm2接种至24孔培养板中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，3d后第一次换液，之后隔天换液一次；S4、细胞培养12d后，吸去培养液，将细胞置于0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，用吸管反复吹打，之后800r/min离心10min，细胞沉淀用K-SFM重悬，细胞悬液以1：2比例传代培养，36h后第一次换液，之后隔天换液一次；S5、通过逆转录病毒感染S4中制备的口腔黏膜上皮细胞，诱导口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞。实施例3S1、口腔黏膜组织的预处理；将口腔黏膜组织含有双抗的生理盐水清洗3次后，浸泡于2g/L庆大霉素溶液浸泡8min，之后用含有0.06％的苯扎溴铵浸泡10min，预处理结束后用眼科剪去除黏膜下组织，并将口腔黏膜组织修剪成1x1cm的组织块；S2、口腔黏膜细胞的分离；将S1中处理后的组织块置于0.5％的Dispase溶液中浸泡11h，4℃消化，取出后用眼科剪分离上皮层和下皮层，弃去下皮层；S3、口腔黏膜细胞的培养；将S2中得到的上皮层细胞加入至0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，37℃消化25min，其中胰酶与EDTA的体积比为1：1，用10％胎牛血清中止消化，用吸管吹打单细胞悬液，1000r/min离心8min，弃上清，加入至DefinedK-SFM中重悬细胞，以2.5x104个/cm2接种至24孔培养板中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，3d后第一次换液，之后隔天换液一次；S4、细胞培养11d后，吸去培养液，将细胞置于0.25％胰酶-0.02％EDTA溶液中消化，用吸管反复吹打，之后8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、口腔黏膜组织的预处理；S2、口腔黏膜细胞的分离；S3、口腔黏膜上皮细胞体外培养；S4、口腔黏膜上皮细胞消化传代。
【技术特征摘要】
1.一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、口腔黏膜组织的预处理；S2、口腔黏膜细胞的分离；S3、口腔黏膜上皮细胞体外培养；S4、口腔黏膜上皮细胞消化传代。2.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，其特征在于：S1中的具体步骤为，将口腔黏膜组织含有双抗的生理盐水清洗2-3次后，浸泡于2g/L庆大霉素溶液浸泡5-10min，之后用含有0.06％的苯扎溴铵浸泡8-15min，预处理结束后用眼科剪去除黏膜下组织，并将口腔黏膜组织修剪成1x1cm的组织块。3.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜上皮细胞重编程为多能干细胞的方法，其特征在于：S2中的具体步骤为，将处理后的组织块置于0.4-0.6％的Dispase溶液中浸泡10-12h，4℃消化，取出后用眼科剪分离上皮层和下皮层，弃去下皮层。4.根据权利要求1所述的一种口腔黏膜...
【专利技术属性】
技术研发人员：张正亮，
申请(专利权)人：安徽惠恩生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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