一种大规模制备动物富血小板血浆的方法技术

本发明专利技术公开了动物富血小板血浆（PRP）的制备方法，该方法为：对动物进行采血，抗凝处理，其中抗凝剂占血液体积比为4~7%，20‑24℃静置，并于2小时内进行离心分离；按设定参数进行第一次离心，对第一次离心后得到的上层及白膜层至15~50 mL无菌离心管中进行第二次离心，并设定离心参数；上层1/2体积血浆为PPP；下层1/2体积血浆轻柔吹打混匀为PRP。采用该方法能批处理量血液；能满足用户稳定性需求；室温处理，避免激活血小板启动凝集反应形成纤维蛋白交联网络。血小板室温下半衰期为7天，该制备方法能保证处理的时效性，最大程度保证了血小板的活力；全程采用无菌操作，避免污染风险。

A method for large-scale preparation of animal platelet rich plasma

The present invention discloses animal platelet rich plasma (PRP) preparation method, the method is as follows: blood, on animal anticoagulant treatment, the anticoagulant blood volume ratio of 4~7% accounted for 20, 24 C static, centrifugal separation and in 2 hours; according to set parameters for the first time from the heart, second for the first time by centrifugation after centrifugation and the upper layer to the 15~50 mL albuginea sterile centrifugal tube, and set centrifugal parameters; the upper 1/2 plasma volume is PPP; the lower 1/2 plasma volume mixing PRP gentle percussion. This method can be used for batch processing of blood, and can meet the stability needs of users; room temperature treatment, to avoid activating platelet initiation agglutination reaction to form fibrin cross-linking network. The half-life of platelet at room temperature is 7 days. The preparation method can ensure the timeliness of treatment and ensure the viability of platelet to the maximum extent. Aseptic operation is adopted throughout the process to avoid the risk of contamination.

【技术实现步骤摘要】
一种大规模制备动物富血小板血浆的方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种大规模制备动物富血小板血浆（PRP）的方法。
技术介绍
已发表的PRP文献数量众多，由于制备方法、术语使用、发表形式以及PRP广大的应用范围，报道的结果有许多出入。根据包含细胞种类及纤维蛋白结构的不同，现行的制备富血小板血浆主要分为四类：一、纯富血小板血浆（P-PRP），或无淋巴细胞富血小板血浆（Leucocyte-PRP）：该类PRP不含白细胞，激活后形成低密度纤维蛋白网络结构；二、含淋巴细胞富血小板血浆（L-PRP）：包含白细胞，激活后形成低密度纤维蛋白网络结构，商品化PRP及实验用PRP多为此类；三、纯富血小板纤维蛋白（P-PRF），或无淋巴细胞富血小板纤维蛋白，不含淋巴细胞，具高密度纤维蛋白网络结构，该类产品以高度激活的凝胶形式存在，不能用于注射以及传统纤维蛋白凝胶用途；四、含淋巴细胞富血小板纤维蛋白（L-PRF），或次生PRP，含白细胞，含高密度纤维蛋白网络结构。制备PRP的方法众多，建立的不同方法均基于PRP法以及白膜层法。在PRP法中，第一次离心分离去除红细胞，抗凝血离心后分为三层，上层包含绝大多数血小板及白细胞，中间层即白膜层，富含白细胞，底层绝大部分为红细胞。制备P-PRP时，取上层及中间层的表层部分；制备L-PRP时，取上层、中间层及下层的表层部分。第二次离心时，选取合适的离心力使血小板（红细胞-血小板）在离心容器底部松散聚集，上层1/3体积为PPP，下层2/3体积重悬后即为PRP。白膜层法分离PRP第一次离心使用高离心力，上层为PPP，白细胞和血小板集中于中间白膜层，转移白膜层进行第二次低速离心，去除白细胞。见报道的有很多制备PRP的方法，各自基于不同侧重点进行，如制备体积、抗凝剂的使用、离心次数、离心时间等，造成了产品稳定性和可重复性的问题，大规模制备动物PRP尚未见报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种稳定性好、可重复性的大规模制备动物富血小板血浆（PRP）的方法。为达到上述目的，本专利技术是通过以下的技术方案来实现的。一种大规模制备动物富血小板血浆的方法，包括以下步骤：（1）采血：对动物进行采血，将动物血液收集到离心瓶中，加入抗凝剂，使血液与抗凝剂充分混匀，避免凝血；其中抗凝剂占血液的体积比为4~7%，（2）采好的血液在20-24℃条件下静置，得到抗凝血，所述抗凝血于2小时内进行离心分离；（3）第一次离心：将步骤（2）得到的抗凝血移入15~50mL无菌离心管，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速2300~2600rpm，时间15~18min，温度20-22℃；（4）第二次离心：转移第一次离心后得到的上层及白膜层至15~50mL无菌离心管中，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速3800~4100rpm，时间15~18min，温度20-22℃；（5）分离PPP：上层1/2体积血浆为PPP；（6）分离PRP：下层1/2体积血浆轻柔吹打混匀，为PRP。进一步地，所述的抗凝剂为质量浓度为5%的柠檬酸钠溶液。进一步地，所述的抗凝剂占血液的体积比为5%。进一步地，步骤（3）中，第一次离心分离的条件：转速2500rpm，时间15min，温度20℃。进一步地，步骤（4）中，第二次离心分离的条件：转速4000rpm，时间15min，温度20℃。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、处理量大：能批处理量血液；2、稳定：大体积处理最大程度降低了批次数，满足用户稳定性需求；3、避免激活：室温处理，避免激活血小板启动凝集反应形成纤维蛋白交联网络。4、及时：血小板室温下半衰期为7天，该制备方法能保证处理的时效性，最大程度保证了血小板的活力。5、无菌：全程采用无菌操作，避免污染风险。具体实施方式下面结合实例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1：大规模制备山羊富血小板血浆制备方法包括以下步骤：（1）采血：对山羊颈静脉插管进行采血，取适量抗凝剂加入离心杯中，颠倒数次润湿内壁，动物颈静脉插管采血，收集到离心瓶中，持续摇动离心瓶，加入剩余抗凝剂，使血液与抗凝剂充分混匀，避免凝血；其中抗凝剂占血液的体积比为5%，（2）采好的血液在20~24℃条件下静置，得到抗凝血，抗凝血于2小时内进行离心分离；（3）第一次离心：将步骤（2）得到的抗凝血移入50mL无菌离心管，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速2500rpm，时间15min，温度20℃；（4）第二次离心：转移第一次离心后得到的上层及白膜层至50mL无菌离心管中，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速4000rpm，时间15min，温度20℃；（5）分离PPP：上层1/2体积血浆为PPP；（6）分离PRP：下层1/2体积血浆轻柔吹打混匀，为PRP。采用上述方法，能批量处理大于1000mL血液，并且减少了处理的次数，从而提高了血液的稳定性；室温处理，避免激活血小板启动凝集反应形成纤维蛋白交联网络，保证了处理的时效性，最大程度保证了血小板的活力；血小板最终回收率为91.2%。实施例2，大规模制备兔富血小板血浆制备方法包括以下步骤：（1）采血：对兔进行心脏采血，取适量抗凝剂加入离心杯中，颠倒数次润湿内壁，动物颈静脉插管采血，收集到离心瓶中，持续摇动离心瓶，加入剩余抗凝剂，使血液与抗凝剂充分混匀，避免凝血；其中抗凝剂占血液的体积比为5%，（2）采好的血液在20~24℃条件下静置，得到抗凝血，抗凝血于2小时内进行离心分离；（3）第一次离心：将步骤（2）得到的抗凝血移入15mL无菌离心管，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速2500rpm，时间15min，温度20℃；（4）第二次离心：转移第一次离心后得到的上层及白膜层至15mL无菌离心管中，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速4000rpm，时间15min，温度20℃；（5）分离PPP：上层1/2体积血浆为PPP；（6）分离PRP：下层1/2体积血浆轻柔吹打混匀，为PRP。采用上述方法，能批量处理大于100mL血液，并且减少了处理的次数，从而提高了血液的稳定性；室温处理，避免激活血小板启动凝集反应形成纤维蛋白交联网络，保证了处理的时效性，最大程度保证了血小板的活力；血小板最终回收率为92.7%。实施例3，与实施例1基本相同，所不同的是：抗凝剂占血液的体积比为4%。步骤（3）中，第一次离心分离的条件：转速2300rpm，时间16min，温度21℃。步骤（4）中，第二次离心分离的条件：离心的条件为：转速3800rpm，时间16min，温度21℃。采用上述方法，能批量处理大于1000mL血液，并且减少了处理的次数，从而提高了血液的稳定性；室温处理，避免激活血小板启动凝集反应形成纤维蛋白交联网络，保证了处理的时效性，最大程度保证了血小板的活力；血小板最终回收率为90.5%。实施例4，与实施例1基本相同，所不同的是：抗凝剂占血液的体积比为7%。步骤（3）中，第一次离心分离的条件：转速2600rpm，时间18min，温度22℃。步骤（4）中，第二次离心分离的条件：离心的条件为：转速4100rpm，时间18min，温度22℃。采用上述方法，能批量处理大于1000mL血液，并且减少了处理的次数，从而提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大规模制备动物富血小板血浆的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采血：对动物进行采血，将动物血液收集到离心瓶中，加入抗凝剂，使血液与抗凝剂充分混匀，避免凝血；其中抗凝剂占血液的体积比为4~7%，（2）采好的血液在20‑24℃条件下静置，得到抗凝血，所述抗凝血于2小时内进行离心分离；（3）第一次离心：将步骤（2）得到的抗凝血移入15~50 mL无菌离心管，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速2300 ~2600rpm，时间15 ~18min，温度20‑22℃；（4）第二次离心：转移第一次离心后得到的上层及白膜层至15~50 mL无菌离心管中，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速3800 ~4100rpm，时间15 ~18min，温度20‑22℃；（5）分离PPP：上层1/2体积血浆为PPP；（6）分离PRP：下层1/2体积血浆轻柔吹打混匀，为PRP。

【技术特征摘要】
1.一种大规模制备动物富血小板血浆的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采血：对动物进行采血，将动物血液收集到离心瓶中，加入抗凝剂，使血液与抗凝剂充分混匀，避免凝血；其中抗凝剂占血液的体积比为4~7%，（2）采好的血液在20-24℃条件下静置，得到抗凝血，所述抗凝血于2小时内进行离心分离；（3）第一次离心：将步骤（2）得到的抗凝血移入15~50mL无菌离心管，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速2300~2600rpm，时间15~18min，温度20-22℃；（4）第二次离心：转移第一次离心后得到的上层及白膜层至15~50mL无菌离心管中，配平后放入离心机离心，离心的条件为：转速3800~4100rpm，时间15~18min，温度20-22℃；（5）分离PPP：上层1/2体积血浆为PPP；（6）分离PRP：下层1/2体积血浆轻柔吹打混匀，为PRP。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王耀，袁金城，王成新，江晓，
申请(专利权)人：海奥斯生物科技镇江有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32