一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法技术

本发明专利技术公开了一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，该方法包含以下几个步骤，酵母细胞液的获取，然后进行酵母细胞的破碎，添加有机溶剂萃取，提取上清液并浓缩，最后添加辅料后制成；通过从废弃的啤酒酵母泥中提取酵母，破碎酵母，利用酵母提取液作为底液，添加其他活性成分，制成的一种猪精液低温储存的稀释液，同时控释微波的功率和添加乙醇的浓度，不仅提取到了一定的酵母海藻糖，还成功的从加入的葡萄籽粉中提取到了一定量的原花青素，证明都是很好的冷冻精液稀释液中非常好的抗氧化物质，有效冷冻稀释液的猪精液保存效果。

Preparation method of antioxidant diluent for cryopreservation of boar semen

The invention discloses a method for cryopreservation of boar semen dilution oxidation preparation method, the method includes the following steps to obtain yeast cell liquid, and then broken yeast cells, adding organic solvent extraction, extraction supernatant and concentrated, made finally adding accessories; through the extraction of yeast from beer yeast mud waste in the broken yeast, using yeast extract as the bottom liquid, add other active ingredients, dilution of pig semen from low temperature storage, controlled release and microwave power at the same time, ethanol concentration, extraction of trehalose not only to certain, also successfully added from grape seed extract powder to a certain amount procyanidins, antioxidants are proved very good very good frozen semen in the pig semen preservation effect frozen diluent.

【技术实现步骤摘要】
一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法
本专利技术属于饲养业的工艺
，具体涉及到一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法。
技术介绍
精液保存是猪人工授精技术的关键，它既可以延长精子的贮存时间，又便于长途运输，同时扩大了精液的使用范围，提高公猪的配种效能，加快猪群品种改良。猪精液低温保存技术在运输和操作上，相对冷冻保存而言简便、经济，而保存时间比常温保存长、成本低。目前低温保存研究还停留在稀释液的筛选阶段。冷冻保护是影响猪冻精质量的重要因素，自从人们发现甘油的冷冻保护特性后，迅速促进了家畜冷冻精液的发展，但是，甘油作为一种渗透性冷冻保护剂，能都渗入精子细胞的内部，浓缩或结合细胞内水分，降低溶液中盐的浓度和稀释液的渗透压，一方面对精子有保护作用，另一方面又对精子有一定的毒害作用，部分精子经脱水后冷冻效果较好，但结冻后却无运动力和受精能力。与牛精子不同的是，猪精子对低温打击极端敏感，而低温打击的主要危害是降低精子活力，增强精子膜的离子通透性，导致精子膜受到损伤和精细胞脂类物质的流失，而镜子膜的完整性对于精子的受精能力至关重要，近年来人们致力于研究非渗透性冷冻保护剂，并结合先稀释液中添加其他成分以改善冻后精子质量。弱酸环境被认为是精液保存的理想环境，但超出一定的酸性范围，容易引起精子死亡。猪精子的等渗渗透压为290～300mosM，可耐受的渗透压为240～380mosM，等渗或稍微高渗的环境比低渗的环境更利于保护精子。可能与稀释液中添加缓冲剂碳酸氢钠和柠檬酸三钠有关，它们可以维持精液pH的动态平衡，虽然成分只有葡萄糖和蔗糖，但二者即作为营养成分满足了精子的能量需要，又维持了渗透压，其中蔗糖在低温条件下还能保护精子的活力和顶体完整率。对于猪精子而言，弱酸和略高的渗透压更利于其4℃低温保存，人工采取的精液易受微生物的污染，而青霉素和链霉素作为稀释液中的抗菌剂，被广泛应用于常温保存稀释液中抑制微生物的生长繁殖，但二者对革兰氏阴性菌如大肠杆菌效果较差。有试验证明庆大霉素对多种革兰氏阴性菌有杀灭作用。
技术实现思路
一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，猪精子与牛精子低温保存的效果不同，在猪精子的低温储存过程中，由于冷冻和解冻的过程发生脂质过氧化反应降低了精子的质量，并导致40~50%的精子失去活力，最主要原因是由于这一过程中精子与外界相互接触，致使精子中的活性氧增加，引起精子膜的流动性改变，线粒体和DNA损伤，降低了精液的品质。但是低温保存精液，低温可以减缓精子的运动，从而降低自身能量的损耗和新陈代谢，有效延长了精子的保存时间。专利技术为了实现低温储存猪精液，同时解决以上出现的冷冻—解冻过程中过多活性氧出现导致的精子损伤率提高的问题，专利技术一种低温保存猪精液的稀释液，具体是通过以下的方法实现的：（1）利用酵母的破碎提取液作为基础稀释液，后期添加其他活性成分，酵母提取液在提取的过程中从细胞溶出的物质包括：蛋白质、低分子肽、氨基酸、核酸降解物、微量元素和B族维生素等各种活性成分，都提供给精子相当完美的模拟生物细胞生存环境，各项活性成分的配比恰到好处，且成分全面，相对于人工配比的精液稀释液，添加的活性物质太多，量的方面不好拿捏，稍有不平衡就有导致稀释液渗透压的不稳定，导致精子因渗透压及其它方面的问题而死亡。不仅如此，酵母细胞还富含丰富的海藻糖，海藻糖不同于蔗糖或是乳糖，它可以在生物活性细胞脱水的情况下，在细胞膜外形成一层保护膜，这一点可以在冷冻的过程中发挥保护细胞的作用，防止猪精子在降温过程中受到的低温打击。首先采用的是啤酒酵母泥作为酵母菌的来源，废酵母泥是啤酒生产过程中的副产物，每年都会造成大量的浪费，这里经过3~5次的水洗，然后离心得到含有酵母菌细胞的酵母菌液，其啤酒酵母的有效活菌数不少于1.0×106cfu/ml。通过微波辐射的作用破碎酵母细胞，微波功率为600~800W的电磁作用环境下2~5min，微波是通过波场中介质的摆动摩擦作用产生能量，具有很好的选择性、瞬时性和高效性，细胞内不同位置的物质，对于微波的吸收能力存在差异，从而导致为波场中的细胞局部受热，细胞在一定的强度下出现缺口而破碎，起到充分裂解酵母细胞的功能。不仅如此，专利技术既然选择微波的破碎细胞方式，同时加入一定量的葡萄籽粉，利用微波的辐射作用和添加的一定量乙醇溶剂，可以在一定程度上提取葡萄籽中含有的原花青素，原花青素是一种新型高效抗氧化剂，属于一类有着特殊分子结构的生物类黄酮，溶于水和大多数的有机溶剂，已有文献证明在猪精液的冷冻保护方面，其抗氧化性能使维生素E的50倍，维生素C的20倍，是一种高效清除自由基的细胞内活性物质，同时参与磷酸、花生四烯酸的代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤。将葡萄籽研磨过80~120目筛的微粉，待前述酵母细胞破碎稀释液冷却后添加至混合其中，然后加入有机溶剂乙醇，控制乙醇浓度50~70%，将微波辐射的功率调整为250~400W，作用30~50min，属于提取过程，在微波辐射的环境下，有机溶剂可以同时实现对酵母细胞中活性成分的提取，其中包括海藻糖，同时可以提取葡萄籽粉中的原花青素。这里很好的控制了微波的辐射功率，即利用高功率的辐射先杀死并破碎酵母细胞，同时高辐射带来高温，不利于后期长时间的萃取过程，在萃取的过程中合理的控制微波功率使稀释液的温度始终在60~80℃，比较符合提取的温度，同时葡萄籽粉与酵母破碎稀释液的料液比控制在1:15~20的时候，原花青素的的提取量达到最高。完成后的稀释液含有提取后的酵母细胞和葡萄籽粉残余物，这类不规则大颗粒物质，会对精子细胞膜造成机械性损伤；同时，大颗粒物质使得精液稀释后变得浑浊，加上精子会游向大颗粒物质并附着在其边缘，严重影响后期受精，所以专利技术选择加入一定量的生物絮凝剂羧甲基纤维素钠，浓度为15~20g/L，于恒温水浴中保温20min后再进行离心处理，取上清液，通过减压蒸馏回收乙醇，真空度0.08MPa的条件下，升温至60~70℃沸腾回流回收乙醇并浓缩提取液。适量的加入羧甲基纤维素钠还有一个好处，在于可以增加溶液一定的粘稠度，提高稀释液的发散程度，使精子均匀的悬浮在稀释液中，可以提高稀释液对精子的保护作用，有利于精子活率、活力的维持，同时明显提高精子脂膜完成率和顶体完整率，原理是粘稠的稀释液可以降低精子的运动能力，减少不必要的能量消耗。最后添加辅料，搅均匀即可，辅料占上述提取稀释液的10~20%，由以下重量百分比的原料制成：青霉素5~10%、乙二胺四乙酸钠10~15%、卵黄4~12%、葡萄糖30~60%、柠檬酸10~25%、谷氨酸5~15%、半胱氨酸6~18%。本专利技术的有益效果：通过从废弃的啤酒酵母泥中提取酵母，破碎酵母，利用酵母提取液作为底液，添加其他活性成分，制成的一种猪精液低温储存的稀释液，同时控释微波的功率和添加乙醇的浓度，不仅提取到了一定的酵母海藻糖，还成功的从加入的葡萄籽粉中提取到了一定量的原花青素，证明都是很好的冷冻精液稀释液中非常好的抗氧化物质，有效冷冻稀释液的猪精液保存效果。具体实施方式实施例1：（1）首先采用的是啤酒酵母泥作为酵母菌的来源，经过3~5次的水洗，然后离心得到含有酵母菌细胞的酵母菌液，其啤酒酵母的有效活菌数不少于1.0×106cfu/ml。（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，其特征在于：该方法包含以下几个步骤，酵母细胞液的获取，然后进行酵母细胞的破碎，添加有机溶剂萃取，提取上清液并浓缩，最后添加辅料后制成。

【技术特征摘要】
1.一种低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，其特征在于：该方法包含以下几个步骤，酵母细胞液的获取，然后进行酵母细胞的破碎，添加有机溶剂萃取，提取上清液并浓缩，最后添加辅料后制成。2.根据权利要求1所述低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，其特征在于，所述酵母细胞的获取是将啤酒酵母泥作为酵母菌的来源，经过3~5次的无菌水水洗，离心得到含有酵母菌细胞的悬浮液，其啤酒酵母的有效活菌数不少于1.0×106cfu/ml。3.根据权利要求1所述低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，其特征在于，所述酵母细胞的破碎是将酵母悬浮液通过微波功率为600~800W的电磁作用环境下2~5min进行的。4.根据权利要求1所述低温保存猪精液的抗氧化稀释液制备方法，其特征在于，所述添加有机溶剂萃取过程是将葡萄籽研磨过80~120目筛的微粉，按料液比1:15~20的比例加入至破碎后的酵母细胞液中，然后加入有机溶剂，将微波辐射的功率调整为250~400W，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓衍安，陈军辉，
申请(专利权)人：安徽泗县成安牧业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34