一种用于体内示踪和人工清除CAR-T细胞的标签和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于体内示踪和人工清除CAR‑T细胞的标签，包括：如SEQ ID NO.18所示序列的示踪铰链Trace‑Linker1、如SEQ ID NO.19所示序列的示踪铰链Trace‑Linker2、如SEQ ID NO.20所示序列的示踪铰链Trace‑Linker3。此外，本发明专利技术还公开了包括上述标签的CAR‑T治疗载体及其构建方法。此外，本发明专利技术还公开了该标签在制备CAR‑T治疗载体和治疗三阴乳腺癌的药物中的应用。本发明专利技术标签使得CAR‑T细胞在不影响肿瘤杀伤效果的前提下，能够对CAR‑T细胞进行可控的体内示踪、体外分离、人工清除，能极大的提高CAR‑T细胞治疗的安全性，能够为更深入的解析CAR‑T细胞治疗的过程提供有力的工具。本发明专利技术载体可实现在人T淋巴细胞上表达CD117的靶向嵌合抗原受体，引导并激活T淋巴细胞对CD117阳性细胞的杀伤作用，在临床上可用于治疗三阴性乳腺癌。

For in vivo tracking and manual removal of CAR T cell labeling and Application

The invention discloses a label for in vivo tracing and artificial removal of CAR T cells including: SEQ ID NO.18 sequence shown in Trace Linker1, such as hinge tracer SEQ ID NO.19 sequence shown in Trace Linker2, tracer hinge shown in the sequence of SEQ ID NO.20 tracer Trace Linker3 hinge. In addition, the invention also discloses a CAR T treatment carrier comprises the label and its construction method. In addition, the invention also discloses the application of the preparation of CAR T drug label therapy vector treatment and three negative breast cancer for the. The invention makes the CAR label in T cells without affecting tumor killing effect, and in vitro and in vivo tracing can be controlled to remove artificial CAR T cells, can improve the safety of CAR treated T cells greatly, can provide a powerful tool for process analysis of CAR T cells more in-depth treatment the. The invention can realize the vector of human T lymphocytes expressing CD117 receptor to chimeric antigen, guide and activate the cytotoxic effect of T lymphocytes on CD117 positive cells, can be clinically used in treatment of three negative breast cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种用于体内示踪和人工清除CAR-T细胞的标签和应用
本专利技术属于医学生物领域，具体涉及一种生物标签，尤其涉及一种用于体内示踪和人工清除CAR-T细胞的标签。此外，本专利技术还涉及该标签的应用。
技术介绍
肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[BurnetFM.Immunologicalaspectsofmalignantdisease.Lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。CAR-T，全称是ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是通过转基因的手段，将启动子、抗原识别区、共刺激因子、效应区等共同组成的嵌合分子，导入T细胞基因组内，从而使T细胞对靶细胞的识别、信号转导、杀伤等功能融为一体，实现了对靶细胞的特异性杀伤[EleanorJ.Cheadle,etal.CARTcells:drivingtheroadfromthelaboratorytotheclinic.ImmunologicalReviews2014.Vol.257:91–106]。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用CLT019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，截止到2017年2月，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。CAR-T细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。CAR-T目前在在治疗B-淋巴细胞白血病等几种类型的血液肿瘤方面疗效显著，但是，目前针对CAR-T细胞的进入体内后的变化以及人工调控还是一片空白。首先，CAR-T细胞进入体内以后的去向，目前没有合适的手段进行示踪；其次，CAR-T细胞回输后，不同时间点提取的样本中，很难分离出单独的CAR-T细胞群体进行各种类型的检测；再次，一旦CAR-T细胞出现失控的时候，目前没有合适的针对性的手段进行控制；最后，CAR-T细胞制备的过程中，会有较低的概率混入肿瘤细胞，一旦这种肿瘤细胞被转入CAR基因后，CAR基因的表达产物会在肿瘤细胞内部封闭原有抗原，导致肿瘤细胞表达不表达相应抗原，最终导致CAR-T治疗无效。因此，在CAR-T细胞治疗中急需要一种可靠的，可以进行体内示踪、体外分离、人工清除的控制方法。CD117是一种细胞因子受体表达于造血干细胞及其它类型细胞的表面。这种受体的不同剪接体可能与某些类型的癌症有关[EdlingCE,HallbergB(2007)."c-Kit--ahematopoieticcellessentialreceptortyrosinekinase".Int.J.Biochem.CellBiol.39(11):1995–8]。CD117是一种受体酪氨酸激酶III，它与干细胞因子(一种促进某些类型细胞生长的物质)结合，这种干细胞因子也被称为“钢铁因子”或“c–kit配体”。当受体与干细胞因子(SCF)结合时，它会形成一个二聚体，激活其固有的酪氨酸激酶活性，进而磷酸化，激活信号转导分子，在细胞中传播信号。CD117通路传递的信号在细胞存活、增殖和分化中起着重要作用。CD117(c-kit)可以作为三阴乳腺癌(TNBC)的一种重要标志物(KanapathyPillaietal.Triple-negativebreastcancerisassociatedwithEGFR,CK5/6andc-KITexpressioninMalaysianWomen.BMCClinicalPathology2012,12:18)，在未来数年中将会在三阴乳腺癌(TNBC)的CAR-T治疗上起到重要作用。三阴乳腺癌(TNBC)定义为缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及HER2过度表达或基因扩增的乳腺癌亚型。TNBC预后极差，5年生存率不足15％，且复发迅速，诊断后5年内是死亡高峰。患者脑转移发生率高，可迅速出现远处转移而导致死亡。TNBC的标志物表达情况如下表1所示：表1目前，尚未有克服上述缺点针对CD117的可以进行体内示踪、体外分离、人工清除CAR-T细胞治疗的相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种用于体内示踪和人工清除CAR-T细胞的标签，使得CAR-T细胞在不影响肿瘤杀伤效果的前提下，能够对CAR-T细胞进行可控的体内示踪、体外分离、人工清除，能极大的提高CAR-T细胞治疗的安全性，能够为更深入的解析CAR-T细胞治疗的过程提供有力的工具。本专利技术要解决的技术问题之二是提供一种包括上述标签的CAR-T治疗载体。本专利技术要解决的技术问题之二是提供该载体的构建方法。本专利技术要解决的技术问题之三是提供该标签的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：在本专利技术的一方面，提供一种用于体内示踪和人工清除CAR-T细胞的标签，包括：如SEQIDNO.18所示序列的示踪铰链Trace-Linker1、如SEQIDNO.19所示序列的示踪铰链Trace-Linker2、如SEQIDNO.20所示序列的示踪铰链Trace-Linker3。该标签可以广泛用于细胞治疗中，效应细胞的体内示踪、体外分离和抗体依赖的人工清除。作为本专利技术优选的技术方案，所述示踪铰链Trace-Linker1、Trace-Linker2、Trace-Linker3片段，所对应的的抗体药物为利妥昔单抗(Rituximab)，所对应的靶点为B-lymphocyteantigen(CD20)。在本专利技术的第二方面，提供一种CAR-T治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人EF1α启动子、CAR嵌合受体结构域；所述慢病毒骨架质粒包括：用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQIDNO.1所示；用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列，如SEQIDNO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQIDNO.11所示；IRES核糖体结合序列，如SEQIDNO.12所示；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQIDNO.13所示；所述人EF1α启动子的序列如SEQIDNO.14所示；所述CAR嵌合受体结构域包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQIDNO.16所示的CD117单链抗体轻链VL、如SEQIDNO.17所示的CD117单链本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于体内示踪和人工清除CAR‑T细胞的标签，其特征在于，包括：如SEQ ID NO.18所示序列的示踪铰链Trace‑Linker1、如SEQ ID NO.19所示序列的示踪铰链Trace‑Linker2、如SEQ ID NO.20所示序列的示踪铰链Trace‑Linker3。

【技术特征摘要】
1.一种用于体内示踪和人工清除CAR-T细胞的标签，其特征在于，包括：如SEQIDNO.18所示序列的示踪铰链Trace-Linker1、如SEQIDNO.19所示序列的示踪铰链Trace-Linker2、如SEQIDNO.20所示序列的示踪铰链Trace-Linker3。2.如权利要求1所述的标签，其特征在于，所述示踪铰链Trace-Linker1、Trace-Linker2、Trace-Linker3片段，所对应的的抗体药物为利妥昔单抗Rituximab，所对应的靶点为B-lymphocyteantigenCD20。3.一种CAR-T治疗载体，其特征在于，包括慢病毒骨架质粒、人EF1α启动子、CAR嵌合受体结构域；所述慢病毒骨架质粒包括：用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQIDNO.1所示；用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列，如SEQIDNO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQIDNO.11所示；IRES核糖体结合序列，如SEQIDNO.12所示；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQIDNO.13所示；所述人EF1α启动子的序列如SEQIDNO.14所示；所述CAR嵌合受体结构域包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQIDNO.16所示的CD117单链抗体轻链VL、如SEQIDNO.17所示的CD117单链抗体重链VH、权利要求1所述的任意一种示踪铰链、如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、如SEQIDNO.25所示的TCR嵌合受体T细胞激活域以及嵌合受体共刺激因子区域；所述嵌合受体共刺激因子区域选自4-1BB、ICOS、CD27、OX40、CD28、MYD88、IL1R1、CD70、TNFRSF19L、TNFRSF27、TNFRSF1OD、TNFRSF13B、TNFRSF18、CD134等肿瘤坏死因子超家族中的任意一种或多种的组合。4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体或第三代慢病毒载体；所述第二代慢病毒载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件；所述第三代慢病毒载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件，以及如SEQIDNO.4所示的RSV启动子。5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396G&g...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁伟，俞磊，康立清，林高武，余宙，
申请(专利权)人：上海优卡迪生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31