酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚A的方法技术

本发明专利技术提供一种酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚A的方法，包括：巯基化的适配体和葡萄糖氧化酶、偶联剂溶液混合，将金种加入到氯金酸溶液中，同时迅速加入抗坏血酸和硝酸银溶液，制备金纳米星，再加入适配体互补链DNA2溶液进行偶联，进一步加入4‑硝基苯硫酚乙醇溶液，制备AuNS‑GOx探针溶液，并在AuNS表面生长Ag壳。本发明专利技术成功制备了基于AuNS检测双酚A的超灵敏SERS传感器，首次将酶‑引导晶体生长策略应用于构建SERS生物传感器，建立了目标物浓度与SERS特征峰信号强度之间的线性关系，检测限低至10

【技术实现步骤摘要】
酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚A的方法
本专利技术属于检测领域，具体地，涉及一种双酚A的表面增强拉曼光谱检测方法。
技术介绍
近年来，食品安全问题严重危害人类健康，已经引起了人们的广泛关注。由于表面增强拉曼散射光谱(SERS)具有低检测限、窄光谱带宽等独特优势，特别是纳米材料学的发展，使得SERS在食品安全检测领域的应用逐年增多。同传统红外光谱法相比，SERS技术不仅能提供被检测物详细的结构信息，同时由于水分子的拉曼散射截面小，从而可以忽视背景从水相体系中直接有效地获得生物分子的振动信息进而检测生物分子，甚至其检测限可达单分子水平。由于SERS具有低检测限、窄光谱带宽、荧光猝灭能力和无光学标签使用限制等诸多优点，使得SERS广泛应用于食品安全检测、DNA/RNA分析及检测、遗传学和蛋白质组学、医疗诊断和化学试剂检测等。在上述的研究背景下，本专利技术将引用基于高增强因子金/银纳米材料的SERS技术在食品安全检测方法方面开展工作，以目前常见的导致食品安全问题的物质双酚A(BPA)为研究对象，建立具有高灵敏度和高特异性的检测新方法，拓宽拉曼光谱技术在食品安全检测领域的应用范围，建立新型简单、快速灵敏的检测方法来满足食品安全检测领域日益增长的检测需求。分子的拉曼散射是一种非弹性的散射过程，其散射截面约为10-29cm2/分子。同其他光学过程如荧光(10-19cm2/分子)的横截面相比，拉曼散射是一种很弱的现象，这导致常规拉曼散射在测量低浓度分子时一般都存在严重的缺陷(尤其是背景荧光比较突出的时候)。虽然已有许多科研者对SERS技术在食品安全检测中的应用进行了研究，但同其他检测技术(如常规光谱检测技术、色谱检测技术和生物检测技术等)一样，SERS技术的应用仍有很大的局限性。比如大部分SERS基底增强效应偏低、SERS检测模式不够多样化等缺陷，这些因素导致SERS技术在食品安全检测领域的应用主要集中于定性分析，在定量方面尚未成为人们依赖的检测手段。因此建立应用于食品安全检测领域的基于SERS的新型定量方法仍十分迫切。酶引导晶体成长策略是以酶作为一种高效的催化剂催化底物产生还原剂，可通过还原剂还原金属离子(主要是Au3+/Ag+)并沉积在纳米粒子表面。因此，通过酶来引导控制晶体生长过程，协调其物理化学性质，并决定晶体纳米结构的形状和大小。基于结合酶的高效催化特性和金属沉积物的高灵敏SPR-响应，因此对于酶-引导银沉积的研究更为广泛。虽然酶-引导银沉积已被应用于多种方法中，但目前还没有人将其应用于SERS传感器设计。
技术实现思路
针对本领域存在的不足之处，本专利技术提出一种酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚A的方法，利用适配体互补链(DNA2)与信标4-硝基苯硫酚(4-NTP)功能化的AuNS为SERS探针，建立一种基于葡萄糖氧化酶酶-引导晶体生长策略的超灵敏检测目标物双酚A的SERS方法，拓宽SERS的检测模式及范围。实现本专利技术目的的技术方案为：一种酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚A的方法，包括步骤：(1)适配体(Aptamer；Apt)与葡萄糖氧化酶(GOx)偶联物的制备：适配体溶液和葡萄糖氧化酶、偶联剂的溶液混合，制备适配体与葡萄糖氧化酶偶联物(Apt-GOx)溶液；所述偶联剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；(2)AuNS的制备：通过向HAuCl4溶液中加入柠檬酸三钠，获得Au种的溶液；将Au种的溶液加入到HAuCl4溶液中，同时迅速加入抗坏血酸(AA)和AgNO3溶液，室温孵化直至溶液由浅红变为墨绿色。(3)功能化AuNS的制备：向步骤(2)制备的AuNS溶液中加入与所述巯基化的适配体互补的DNA2溶液，再加入4-硝基苯硫酚(4-NTP)乙醇溶液，常温振荡孵化10～15h，通过固液分离除去多余的DNA2和4-硝基苯硫酚，沉积物复溶于超纯水中。(4)AuNS-GOx探针的制备：向步骤(3)得到的功能化AuNS溶液中加入适配体与葡萄糖氧化酶偶联物(Apt-GOx)溶液，再加入不同浓度的双酚A标准样品溶液。常温孵化后，固液分离，固体物复溶于2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)缓冲液中。我们将这种混合物命名为AuNS-GOx探针溶液。(5)AuNS的Ag壳生长；向步骤(4)得到的AuNS-GOx探针溶液中加入葡萄糖溶液，孵化1h后加入AgNO3，常温孵化2h后测定表面增强拉曼散射SERS信号。其中，步骤(1)中，取0.1～0.3M巯基化的适配体溶液和(0.5～2)×10-5M葡萄糖氧化酶溶液、(1～10)×10-4M偶联剂的溶液混合，适配体溶液、葡萄糖氧化酶溶液、偶联剂溶液的体积比为1:100:(20～40)。本专利技术优选技术方案之一为，步骤(1)中，所述巯基化的寡核苷酸溶液通过以下方法得到：巯基化的寡核苷酸溶解于pH为7.5～8.5的缓冲液中，配成100μM的溶液，再加入20～40倍体积的15mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(TCEP)在20～30℃下孵化1～3h，4℃保藏。所述缓冲液为Tris、HCl、EDTA、吐温、磷酸盐中的一种或多种配制而成。其中，步骤(1)中，所述葡萄糖氧化酶、偶联剂溶液是：浓度为1×10-5M的葡萄糖氧化酶，浓度为5×10-4MSulfo-SMCC偶联剂在pH7.4的PB缓冲液中配制，然后孵化30～50min。其中，步骤(2)中，Au种的溶液浓度为10～20nM，HAuCl4溶液浓度为0.1～0.5mM，Au种加入到HAuCl4溶液后，迅速加入浓度为0.1M抗坏血酸(AA)和1mM的AgNO3溶液，Au种溶液、HAuCl4溶液抗坏血酸、AgNO3溶液体积比为0.1～0.3：20：0.05～0.2：0.05～0.2。进一步地，步骤(3)中，先向AuNS溶液中加入浓度为50～200μM的DNA2溶液，常温振荡孵化3h，再加入1mM的4-NTP乙醇溶液，AuNS溶液、DNA2溶液，4-NTP乙醇溶液的体积比为1000：0.5～3：1～10。其中，步骤(4)中，向功能化AuNS溶液中加入10-13g/mL适配体与葡萄糖氧化酶偶联物(Apt-GOx)，再加入浓度为0、10-18g/mL～10-12g/mL系列浓度的双酚A标准样品溶液。固体物复溶于的2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)缓冲液可以为10mM，pH5.9的缓冲液。步骤(4)常温孵化的时间可以是7～10h。其中，步骤(5)具体为：向AuNS-GOx探针溶液中加入100mM葡萄糖溶液，孵化1h后加入0.1mM的AgNO3和40mM氨水溶液，常温孵化测定表面增强拉曼散射SERS信号，其中，拉曼检测的激发波长为50～820nm，测定1300～14001339cm-1处的SERS峰为4-NTP的特征峰。具体可以是激发波长为785nm，1339cm-1处的SERS峰为4-NTP的特征峰。更进一步地，所述方法还包括操作：构建表面增强拉曼散射SERS信号和双酚A标准样品溶液浓度的数学关系；对未知双酚A含量的样品进行同样检测，求得样品中双酚A含量。本专利技术方法具有以下优点：本专利技术成功制备了一种基于AuNS检测双酚A的超灵敏SERS传感器。首次将酶-引导晶体生长策略应用于构建SERS生物传感器。建立本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚A的方法，其特征在于，包括步骤：(1)适配体与葡萄糖氧化酶偶联物的制备：巯基化的适配体溶液和葡萄糖氧化酶、偶联剂的溶液混合，制得适配体与葡萄糖氧化酶偶联物溶液；所述偶联剂为4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；(2)AuNS的制备：通过向HAuCl4溶液中加入柠檬酸三钠，获得Au种的溶液；将Au种的溶液加入到HAuCl4溶液中，同时迅速加入抗坏血酸和AgNO3溶液，室温孵化直至溶液由浅红变为墨绿色；(3)功能化AuNS的制备：向步骤(2)制备的AuNS溶液中加入与所述巯基化的适配体互补的DNA2溶液，再加入4‑硝基苯硫酚乙醇溶液，常温振荡孵化10～15h，通过固液分离除去多余的DNA2和4‑硝基苯硫酚，沉积物复溶于超纯水中；(4)AuNS‑GOx探针的制备：向步骤(3)得到的功能化AuNS溶液中加入适配体与葡萄糖氧化酶偶联物溶液，再加入不同浓度的双酚A标准样品溶液，常温孵化后，固液分离，固体物复溶于2‑(N‑吗啉)‑乙磺酸缓冲液中；(5)AuNS的Ag壳生长：向步骤(4)得到的AuNS‑GOx探针溶液中加入葡萄糖溶液，孵化后加入AgNO3，常温孵化后测定表面增强拉曼散射信号。...

【技术特征摘要】
1.一种酶引导晶体生长增强拉曼光谱表面效应检测双酚A的方法，其特征在于，包括步骤：(1)适配体与葡萄糖氧化酶偶联物的制备：巯基化的适配体溶液和葡萄糖氧化酶、偶联剂的溶液混合，制得适配体与葡萄糖氧化酶偶联物溶液；所述偶联剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；(2)AuNS的制备：通过向HAuCl4溶液中加入柠檬酸三钠，获得Au种的溶液；将Au种的溶液加入到HAuCl4溶液中，同时迅速加入抗坏血酸和AgNO3溶液，室温孵化直至溶液由浅红变为墨绿色；(3)功能化AuNS的制备：向步骤(2)制备的AuNS溶液中加入与所述巯基化的适配体互补的DNA2溶液，再加入4-硝基苯硫酚乙醇溶液，常温振荡孵化10～15h，通过固液分离除去多余的DNA2和4-硝基苯硫酚，沉积物复溶于超纯水中；(4)AuNS-GOx探针的制备：向步骤(3)得到的功能化AuNS溶液中加入适配体与葡萄糖氧化酶偶联物溶液，再加入不同浓度的双酚A标准样品溶液，常温孵化后，固液分离，固体物复溶于2-(N-吗啉)-乙磺酸缓冲液中；(5)AuNS的Ag壳生长：向步骤(4)得到的AuNS-GOx探针溶液中加入葡萄糖溶液，孵化后加入AgNO3，常温孵化后测定表面增强拉曼散射信号。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，取0.1～0.3M巯基化的适配体溶液和(0.5～2)×10-5M葡萄糖氧化酶溶液、(1～10)×10-4M偶联剂的溶液混合，适配体溶液、葡萄糖氧化酶溶液、偶联剂溶液的体积比为1:100:(20～40)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述巯基化的适配体溶液通过以下方法得到：巯基化的适配体溶解于pH为7.5～8.5的缓冲液中，配成100μM的溶液，再加入20～40倍体积的15mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，在20～30℃下孵化1～3h，4℃保藏；所述缓冲液为Tris、H...

【专利技术属性】
技术研发人员：许宙，程云辉，梅博，陈茂龙，汪荣，唐瑶，鲁士珍，
申请(专利权)人：长沙理工大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43